《Food Chemistry》：Rational hapten design enables monoclonal antibody-based immunoassays for class-selective detection of phthalate esters in edible oils
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摘要邻苯二甲酸酯类化合物（PAEs）经常在食用油中被检测到，因此需要快速检测方法。然而，PAEs的分子尺寸小且结构高度相似，使得开发兼具分析灵敏度和基团选择性识别的抗体具有挑战性。本研究通过计算分析指导的合理半抗原设计，获得了一种对邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二烯丙
摘要
邻苯二甲酸酯类化合物（PAEs）经常在食用油中被检测到，因此需要快速检测方法。然而，PAEs的分子尺寸小且结构高度相似，使得开发兼具分析灵敏度和基团选择性识别的抗体具有挑战性。本研究通过计算分析指导的合理半抗原设计，获得了一种对邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二烯丙酯（DAP）和邻苯二甲酸二乙酯（DEP）具有基团选择性识别的杂交瘤单克隆抗体。基于该单抗，开发了间接竞争酶联免疫吸附测定法（ic-ELISA）和胶体金免疫层析试纸条（ICS），用于快速定量检测。优化后的ic-ELISA对DBP、DAP和DEP的半数最大抑制浓度（IC50）分别为20.4、80.1和110.4 ng/mL，而对其他测试邻苯二甲酸酯类似物的交叉反应性均低于1%。ICS可在15分钟内实现目视检测，对食用油中DBP、DAP和DEP的目视检测限（vLODs）分别为20、100和200 ng/mL。通过将计算指导的半抗原设计与互补的定量分析和快速筛选方法相结合，本研究为食用油中PAEs的基团选择性筛查提供了实用平台，并为开发针对结构相关小分子污染物的基团识别抗体提供了有效策略。
引言
邻苯二甲酸酯类化合物（PAEs）是广泛使用的增塑剂，可提高聚合物材料的柔韧性、耐用性和可加工性。由于PAEs与聚合物基质之间没有共价键结合，在加工、包装、储存和运输过程中可从食品接触材料迁移至食品中（Badarou等，2025；Wang等，2023）。食用油尤其容易受到PAEs污染，因为这类化合物的脂溶性有利于其向富含脂质的基质中分配（Badarou等，2025；Luo等，2020）。其中，邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二烯丙酯（DAP）和邻苯二甲酸二乙酯（DEP）是结构相关的PAEs，它们共享相同的邻苯二甲酸骨架但酯侧链不同。长期暴露于PAEs与内分泌干扰、生殖毒性、代谢紊乱及其他不良健康效应相关（Eales等，2022；Xie等，2025）。因此，对食用油中PAEs进行可靠监测对于食品安全评估和污染控制具有重要意义。
为减少潜在的膳食暴露，监管机构对PAEs的监测制定了越来越严格的要求。在中国，GB 5009.271-2016规定了食品中18种PAEs（包括DBP、DAP和DEP）的气相色谱-质谱联用法（GC–MS）测定方法，而LS/T 6131-2018则专门针对植物油中PAEs的测定。GC–MS、高效液相色谱和液相色谱-串联质谱等仪器技术可提供可靠的定量和确证结果。然而，富含脂质的基质中PAEs的分析通常需要在仪器测定前进行提取、净化和基质去除程序（Ghorbani等，2024；Yang等，2025）。这些程序增加了分析时间和成本，并需要精密仪器和经过培训的操作人员，限制了其在快速高通量筛选中的适用性。因此，仍需要简单且具有成本效益的互补方法。
免疫分析法因其操作相对简单、通量高、成本低且对精密仪器的依赖较少而成为有吸引力的替代方法。间接竞争酶联免疫吸附测定法（ic-ELISA）适用于低分子量污染物的灵敏定量分析，而胶体金免疫层析试纸条（ICSs）则提供便携性、目视读取和短检测时间的优势。此前的研究已证明了PAEs免疫化学检测的可行性。Wei等（2011）开发了DBP的ic-ELISA方法，He等（2018）建立了用于食用油中PAEs快速筛选的胶体金免疫层析法（He等，2018；Wei等，2011）。此外，Tang等（2015）证明半抗原结构的合理修饰和间隔臂长度的调整可以影响抗体对多种结构相关PAEs的识别，突出了半抗原设计在开发基团选择性免疫分析方法中的重要性（Tang等，2015）。
然而，PAE免疫分析的主要挑战在于获得兼具足够分析灵敏度和适当识别范围的抗体。PAEs是小分子化合物，缺乏固有的免疫原性，因此在产生抗体前需要进行合理的半抗原设计和载体蛋白偶联。此外，其高度相似的结构使得抗体对特定靶标的识别难以控制。半抗原结构、间隔臂的位置和长度以及免疫过程中暴露的分子特征可以强烈影响抗体的亲和力和交叉反应性（Wang, Qi, Jiang & Liu, 2025；Xu等，2009）。高度单特异性的抗体可能仅识别一种分析物，而过度的或不可控的交叉反应性会降低分析选择性。因此，对于基团选择性筛查，关键挑战在于获得能够识别预定义的、结构相关的PAE组合同时与靶外类似物保持最小交叉反应性的抗体。
大多数已报道的PAE免疫分析方法侧重于个别化合物的单特异性检测，尤其是DBP，或在转化为共同结构标记物后的PAEs总量筛查。相比之下，使用单一抗体对完整的、结构相关的PAEs进行可控的基团选择性识别的研究仍然不充分。对于DBP、DAP和DEP而言，主要挑战在于维持对三种靶标的足够亲和力，同时尽量减少其他PAE类似物的干扰。计算分析提供了一种有用的策略来解决这一问题，可在半抗原合成和免疫前比较分子几何构型、静电性质、构象相似性及其他理化特征（Xu等，2009）。先前的研究也表明，分子模拟可以支持针对结构相关小分子的广谱或基团特异性免疫分析方法的开发（Xu等，2010）。因此，计算指导的半抗原设计可能为平衡抗体灵敏度和基团选择性提供更合理的途径。
虽然现有的大多数ELISA方法聚焦于个别PAEs（特别是DBP）的检测，但很少有研究探索使用单一抗体对DBP、DAP和DEP进行基团选择性识别（表S1）；因此，本研究旨在开发一种灵敏的免疫分析策略，用于在食用油中对这三种PAEs进行快速筛选。采用计算分析指导半抗原的合理设计，随后制备了具有预期识别特征的杂交瘤单克隆抗体。基于该抗体，开发了ic-ELISA用于定量测定，构建了胶体金ICS用于快速目视筛选。与传统的单一分析物PAE免疫分析方法相比，所提出的策略将可控的基团选择性识别与互补的定量分析和快速筛选方法相结合。该方法可提高食用油中PAEs监测的效率，并为开发针对其他结构相关小分子污染物的基团识别抗体提供有用框架。
方法摘要
试剂和设备
以下试剂购自西安齐岳生物科技有限公司：卵清蛋白（OVA）、钥孔蛤血红蛋白（KLH）、小鼠单抗亚型鉴定试剂盒、弗氏佐剂、聚乙二醇1500（PEG-1500）和辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗小鼠IgG抗体。次黄嘌呤-胸苷（HT）和次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷（HAT）补充剂购自上海艾研生物科技有限公司。邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二烯丙酯（DAP）、
计算化学分析与预测半抗原结构
本研究旨在生成对DBP、DAP和DEP具有特异性识别能力的单抗。如图1所示，DBP、DAP和DEP表现出相似的分子结构。理论上，理想的半抗原应密切模拟靶分析物DBP、DAP和DEP的共同结构特征。首先，将DBP和两种候选半抗原分子的三维构象进行叠加，确认苯环和两条碳链构成其特征
结论
本研究利用计算指导的半抗原设计获得了针对DBP、DAP和DEP具有基团选择性识别的杂交瘤单克隆抗体。基于该抗体，开发了互补的ic-ELISA和胶体金免疫层析试纸条检测方法，用于食用油中三种PAEs的定量分析和快速目视筛选。所提出的方法为结构相关PAEs在现场初步筛查和常规监测中提供了实用方案
作者贡献声明（CRediT）
冯倩倩：撰写——初稿、方法论、调查研究、数据整理。刘立强：资源、数据整理。吴艾红：形式分析。许欣欣：验证。匡华：监督指导。徐春来：监督指导、资金获取。徐立光：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、监督指导、资金获取、概念化。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文所述工作的已知的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到国家自然科学基金（22361132536和32471430）和青年教学科研创新能力支持项目（ZYGXQNJSKYCXNLZCXM-H11）的资助。
冯倩倩|刘立强|吴艾红|许欣欣|匡华|徐春来|徐立光
