《Food Chemistry》：Exploring the potential of enzymatic hydrolysis assisted glycosylation to modify β-lactoglobulin fibrils: Insights into aggregation behavior, functional properties and antibody binding capacity
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•提出了一种针对β-LG的序贯修饰策略。•对呈现出不同长度和形态的β-LG纤维进行预处理。•多种修饰方法显著增强了功能性。•序贯修饰有效降低了β-LG的抗体结合能力。引言β-乳球蛋白（β-LG）是牛奶蛋白过敏的主要致敏原之一，具有多种生理活性和重要的营养价值（Huang等，2
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提出了一种针对β-LG的序贯修饰策略。
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对呈现出不同长度和形态的β-LG纤维进行预处理。
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多种修饰方法显著增强了功能性。
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序贯修饰有效降低了β-LG的抗体结合能力。
引言
β-乳球蛋白（β-LG）是牛奶蛋白过敏的主要致敏原之一，具有多种生理活性和重要的营养价值（Huang等，2024）。然而，其功能特性的固有局限性限制了其在食品工业生产中的广泛应用。在蛋白质功能修饰领域，酶解是一种常用且高效的技术手段，具有能耗低、能避免某些极端反应环境造成的样品损伤等优点（Que等，2025）。然而，过度水解会损害功能特性，因此精确调控水解程度尤为重要（Zhou等，2026）。酶解可产生小分子肽并破坏蛋白质天然的紧密构象，从而改善其乳化性和起泡性等功能特性（He等，2022）。此外，糖基化因赋予蛋白质优异的抗氧化和乳化性能而备受关注。转谷氨酰胺酶（TGase）催化的糖基化反应副产物较少，且反应条件温和，避免了传统美拉德反应的不良影响（Wang、Jiang和Shi，2024；Zhao等，2026）。TGase通过脱酰胺或酰基转移反应修饰蛋白质。转酰胺反应涉及与谷氨酰胺残基结合的酰基的γ-羧基向各种伯胺（酰基受体）的转移。由于蛋白质中赖氨酸残基的ε-氨基充当酰基受体，从而形成分子内和分子间ε-(γ-谷氨酰)-赖氨酸交联（Zhou等，2023）。研究表明，TGase诱导的乳铁蛋白与补骨脂多糖之间的相互作用可改变蛋白质结构、暴露疏水基团并增强DPPH和ABTS+自由基清除活性（Wang、Sun等，2024）。类似地，TGase催化的卵类黏蛋白糖基化通过调节疏水区域和油-水界面亲和力来增强乳化性能，同时显著提高了DPPH/ABTS+清除率和起泡能力（Zhu等，2024）。研究表明，通过有限酶解可提高糖基化反应活性，其作用机制在于增加氨基酸残基的暴露程度并改善蛋白质溶解性（Feng等，2024）。目前，降低牛奶致敏性的主流策略包括热处理、糖基化和酶解，这些方法通过破坏蛋白质空间结构或遮蔽致敏表位来降低抗原性。利用不同种类的蛋白酶对β-LG进行水解可破坏β-LG致敏表位，显著降低其抗原性（Pang等，2024；Sun等，2025）。因此，我们推测有限酶解和TGase催化的糖基化可能是同时降低β-LG过敏反应强度并增强其其他特性的有效方法，其原理在于调控β-LG的构象结构和表面疏水性。
近年来，淀粉样纤维聚集已成为蛋白质修饰领域的重要研究方向。淀粉样纤维因其能显著提升溶解性、粘度、起泡性、乳化性、凝胶性和抗氧化性能而备受关注（Meng等，2022）。在酸性环境或存在某些盐离子的体系中，结合高温条件，蛋白质和多肽可自组装成纳米或微米尺度的高度有序、无分支的淀粉样纤维（Wang等，2020）。这种自组装由分子内和分子间相互作用的共同驱动。由于具有高长径比和广泛的β-折叠"空间拉链"区域，纤维在极端环境条件下比天然球形蛋白质具有更优异的稳定性（Han等，2022）。此外，其疏水性和高长径比使其在界面层具有更高的稳定性，从而显著增强乳化性能（Xu等，2025）。此外，纤维形成可通过结构重排产生抗氧化基团，从而增强抗氧化能力（Qi等，2024）。在酸性和高温环境下形成的蛋白质淀粉样纤维可通过暴露的基团和释放的肽片段增强界面吸附，表现出优异的起泡能力（Li等，2021）。研究表明，酶解过程引起的多肽组成变化可阻碍水解蛋白的纤维形成，同时提高其抗氧化能力（Zhang等，2024）。相比之下，糖基化蛋白质能够自组装成淀粉样纤维，且此类纤维结构比单独纤维表现出更突出的乳化活性（Zhang等，2024）。
本研究提出了一种针对β-LG的序贯修饰策略，包括木瓜蛋白酶有限水解、随后以壳寡糖（COS）进行TGase催化的糖基化，以及在不同的时间条件（0–12小时）下诱导淀粉样纤维形成。以β-LG作为对照组，本研究对蛋白质纤维聚集行为、结构特征和功能特性进行了多方面分析，重点关注乳化活性、抗氧化能力、起泡性能和抗体结合能力。本研究有望为β-LG纤维状聚集体的开发与应用在食品工业生产中的推广提供理论基础，并拓展其在食品体系中的潜在应用。
各节摘要
材料
β-LG购自上海麦克林生化科技有限公司（中国上海），蛋白含量为95%。木瓜蛋白酶购自上海源叶生物科技股份有限公司（中国上海）。TGase由江苏易明精细化工有限公司（江苏泰州）提供。COS（分子量约1 kDa）购自浙江金科药业有限公司（浙江台州）。5名牛奶过敏患者的血清（表S1）、免疫球蛋白E（IgE）-辣根过氧化物酶
ThT荧光强度
为了明确有限酶解对后续实验的影响，选用木瓜蛋白酶对β-LG进行酶解，水解度为10.63%。糖基化后，结合于水解β-LG上的COS含量测定为26.66 g/kg。ThT通过识别原纤维表面的特征交叉β结构而特异性结合原纤维，因为这些结构具有ThT的特异性结合位点，从而使ThT荧光
结论
本研究证明，涉及木瓜蛋白酶有限水解、TGase催化的COS糖基化和淀粉样纤维形成的序贯修饰策略能够有效调控β-LG的二级和三级结构，从而对其功能特性产生积极影响。FT-IR和本征荧光光谱证实修饰后β-LG发生了显著的结构变化，而CD光谱揭示了α-螺旋特征性的转变
CRediT作者贡献声明
Jingwen Li：初稿撰写。Jiaqi Shi：审阅与编辑。Yujun Jiang：指导、资源提供。Jia Shi：审阅与编辑、指导。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢
本研究由黑龙江省青年科技人才支持计划（2023QNTJ010）资助。
Jingwen Li|Jiaqi Shi|Yujun Jiang|Jia Shi
