《Environment International》：Single-Cell Metallomics of ovarian granulosa cells enables assessment of Low-Level heavy metal exposure associated with impaired human oocyte development
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研究人员首次揭示低水平环境重金属暴露可能导致女性生殖健康不良结局。卵巢颗粒细胞（granulosa cells, GCs）可作为评估卵母细胞重金属暴露的有效替代物，为人体生物监测（biomonitoring）与暴露评估提供新思路。将单细胞分析用于罕见细胞类型，
研究人员首次揭示低水平环境重金属暴露可能导致女性生殖健康不良结局。卵巢颗粒细胞（granulosa cells, GCs）可作为评估卵母细胞重金属暴露的有效替代物，为人体生物监测（biomonitoring）与暴露评估提供新思路。将单细胞分析用于罕见细胞类型，是探讨低水平环境暴露及其健康影响的新策略。卵泡内卵母细胞周围无血管结构，血-卵泡屏障（blood-follicle barrier）使卵泡液（follicular fluid, FF）中重金属浓度和检出率降低；常规批量检测中的消化稀释预处理也会影响低浓度重金属测量。GCs沿卵泡壁排列，通过分泌因子和代谢物与卵母细胞密切交流，可为卵母细胞提供营养金属，也可能借助类似钙的机制将铅（Pb）等重金属转运至卵母细胞；血液中重金属更多位于血细胞而非血浆，提示重金属更易在细胞内蓄积，因此GCs是表征卵母细胞周微环境低水平金属负荷的信息丰富区室。研究人员利用高灵敏度单细胞金属组学（single-cell metallomics）技术，对接受体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET）女性分离得到的GCs进行检测，使用质谱流式（mass cytometry）在单细胞分辨率下同时检测砷（As）、银（Ag）、镉（Cd）、锑（Sb）、铂（Pt）、金（Au）、汞（Hg）、铅（Pb）、铋（Bi）9种重金属，并以CD99阳性、CD45阴性设门鉴定人GCs。研究人员定义金属平均强度（mean intensity, A）、患病率指数（prevalence index, P）和异质性指数（heterogeneity index, H），其中A为含金属GCs中金属水平均值，P为含金属GCs占比并经校准珠背景校正，H为0到1之间、不依赖每样本GC数量的细胞间差异指标。研究纳入北京朝阳医院2023年9月至2024年2月接受IVF-ET的78名女性，调整女性年龄、体重指数（body mass index, BMI）、卵巢储备下降（diminished ovarian reserve, DOR）、促卵泡激素（follicle-stimulating hormone, FSH）、黄体生成素（luteinizing hormone, LH）及病因类型后，用广义线性模型（generalized linear model, GLM）评估金属分布与卵母细胞/胚胎质量关系，用逻辑回归评估其对妊娠结局影响，并用贝叶斯核机器回归（Bayesian kernel machine regression, BKMR）分析混合物联合效应。结果显示，GCs中As、Hg、Pb强度显著高于CD45-CD99-细胞，Ag、Bi显著更低；GCs中As为0.19（0.16–0.22）fg/细胞，Cd为0.09（0.07，0.10）fg/细胞，Hg为0.08（0.06–0.09）fg/细胞，Pb为0.27（0.15–0.54）fg/细胞；9种金属间存在一定正相关，Pb与其他金属相关性最强。该研究说明，相较卵泡液，GCs金属含量不受穿刺时血液污染和稀释影响，可描述卵泡微环境的细胞内蓄积金属负荷；单细胞金属组学能够保留细胞间异质性，揭示低水平暴露下重金属与生殖结局的潜在多维关联，为低水平重金属暴露对女性生殖健康的风险评估提供单细胞分辨率证据。
研究背景方面，重金属可在人体内蓄积并影响卵母细胞成熟、排卵、胚胎发育和妊娠结局。高暴露水平下，卵泡液中铅（Pb）、汞（Hg）、砷（As）已被发现与卵母细胞和胚胎发育受损、受精潜能下降及妊娠率降低相关。但在极低暴露水平时，卵泡液重金属与卵母细胞发育的关系尚不清楚，文献结果不一致。血-卵泡屏障会导致卵泡液重金属浓度和检出率下降，液体样本的消化与稀释预处理也会干扰低浓度重金属测量。卵泡内卵母细胞周围缺乏血管结构，使得卵母细胞周微环境暴露评估十分重要。卵巢颗粒细胞（granulosa cells, GCs）沿卵泡壁排列，通过分泌因子和代谢物与卵母细胞密切交流，既可为卵母细胞提供必需金属，也可能借助类似钙的转运机制将重金属送至卵母细胞；已有研究提示血液重金属更多位于血细胞而非血浆，说明重金属可能比在体液中更容易在细胞内蓄积。因此，GCs可作为卵母细胞周微环境低水平金属负荷的高信息量区室。此外，GCs自身状态也参与卵泡和卵母细胞发育成熟，重金属可扰乱GCs的DNA甲基化、铁吸收和激素信号通路，进而促进卵泡闭锁和卵母细胞能力降低。该研究发表于《Environment International》，研究人员开展单细胞金属组学（single-cell metallomics）研究，证明GCs可作为评估卵母细胞重金属暴露的有效替代物，并为低水平环境暴露与女性生殖健康风险提供了新证据。
主要关键技术方法方面，研究人员依托体外受精-胚胎移植（IVF-ET）临床流程，从北京朝阳医院2023年9月至2024年2月招募的81名女性中，排除取卵后无卵母细胞和GCs者，最终纳入78名女性来源GCs。研究采用质谱流式（mass cytometry）在单细胞水平检测9种重金属，用CD99阳性、CD45阴性抗体组合从混合穿刺细胞中鉴定人GCs；以铱（Ir）标记DNA用于细胞识别，并用四元素校准珠进行信号校准与质控。研究人员构建金属平均强度（mean intensity, A）、患病率指数（prevalence index, P）和异质性指数（heterogeneity index, H），分别描述含金属细胞平均信号、含金属细胞比例和细胞间金属分布差异。统计上采用Mann-Whitney U检验、广义线性模型（GLM）、逻辑回归，以及贝叶斯核机器回归（BKMR）评估单一金属与金属混合物的效应，并对年龄、BMI、DOR、FSH、LH和病因类型进行校正。
研究结果方面，人口学、临床特征与IVF-ET结局部分显示，78名女性平均34.8岁，约半数≥35岁，平均BMI 23.3 kg/m2，多数文化程度较高、居住于城市、无主动或被动吸烟，约48.7%存在卵巢储备下降（DOR）。每人平均获卵10.6枚，成熟卵母细胞占91.4%，正常受精率66.4%，第3天优质卵裂胚率45.6%，优质囊胚率36.5%；70人首次胚胎移植，临床妊娠率40.0%，早期流产率28.6%，活产率28.6%。单细胞GCs重金属分布特征部分显示，GCs中As、Hg、Pb强度高于CD45-CD99-细胞，Ag、Br相关Bi低于该类细胞；定量上As为0.19 fg/细胞，Cd为0.09 fg/细胞，Hg为0.08 fg/细胞，Pb为0.27 fg/细胞。9种金属间存在一定正相关，Pb与其他金属相关性最强。研究人员由此得出结论：GCs比卵泡液更能反映卵母细胞周微环境的细胞内金属蓄积，且单细胞方法可保留被批量检测掩盖的细胞间异质性。
讨论与结论部分，研究人员指出，传统卵泡液或批量组织检测在低水平暴露场景中受血-卵泡屏障、液体稀释、消化处理和混合细胞异质性限制，难以稳定刻画重金属负担。GCs作为卵母细胞支持细胞，既是营养与信号交流枢纽，也是重金属细胞内蓄积的敏感区室；用质谱流式开展单细胞金属组学，可在不消化、不稀释的前提下直接测量单个GCs中的外源金属，并从混合穿刺样本中选择性获取GCs信号。研究显示低水平As、Hg、Pb等已在GCs中可被检测和定量，且其细胞间分布具有异质性，这与卵母细胞发育、胚胎质量和妊娠结局的分析相连接，能够提供比流体相测量更贴近细胞真实暴露状态的证据。结论上，卵巢颗粒细胞（GCs）是评估卵母细胞周微环境低水平重金属暴露的有效替代物；单细胞金属组学结合罕见细胞类型，是研究低水平环境暴露与生殖健康影响的新策略；GCs中的重金属分布特征可用于探讨卵母细胞成熟、胚胎质量和IVF-ET妊娠结局风险，从而为女性生殖健康的人体生物监测（biomonitoring）和暴露评估提供单细胞分辨率的新路径。
