Irgarol 1051与聚苯乙烯微塑料（PS-MPs）共暴露致厚壳贻贝（Mytilus coruscus）足丝稳态多尺度紊乱：足丝力学、腺体损伤与细胞能量代谢失调

《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》：Multiscale disruption of Byssal homeostasis in Mytilus coruscus Co-exposed to Irgarol 1051 and polystyrene microplastics

　　

Irgarol 1051与聚苯乙烯微塑料（polystyrene microplastics，PS-MPs）损害厚壳贻贝（Mytilus coruscus）的足丝机械性能；共暴露增加足丝斑块（byssus plaque）粗糙度并扰乱足丝蛋白调控；细胞超微结构受损且细胞能量代谢紊乱；Irgarol 1051是足丝毒性的主要驱动因素，而PS-MPs调节毒性。

该论文发表于《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》，由 Yiting Pan、Menghong Hu、Nisha Singh、Jae-Seong Lee、Moslem Sharifinia、Christian Bock、James Kar-Hei Fang、Gisela Lannig、Khor Wai Ho、Youji Wang 等研究人员完成。研究背景在于，防污涂料用于船体、码头桩和声呐罩等水下结构以防止生物污损，并在使用过程中释放杀生剂和含杀生剂颗粒。三丁基锡（tributyltin，TBT）被全球禁用后，Irgarol 1051作为一种三嗪类防污剂被广泛使用，并已在欧洲、日本和澳大利亚沿岸水体中检出；其转化产物M1、M2和M3代谢物具有与母体化合物相当的毒性。Irgarol 1051具有中等疏水性但仍有明显水溶性，主要存在于水柱溶解相，仅少部分与沉积物结合。与此同时，海洋微塑料污染已成为全球性环境问题，双壳类因滤食习性可高效积累微塑料，PS-MPs可与其他有机污染物相互作用，可能改变污染物的生物可利用性和毒性。厚壳贻贝 Mytilus coruscus 是西北太平洋生态和经济重要的双壳类，依靠蛋白性足丝和黏附斑块附着于自然和人工基质；足丝功能直接影响附着、迁移、生长以及养殖存活和经济收益。已有研究表明海水酸化、缺氧、热应激、热浪、流体作用、重金属和工程纳米材料等均可影响足丝结构或功能，但Irgarol 1051与PS-MPs共暴露对足丝稳态的多尺度影响尚不充分。研究人员因此提出假设：PS-MPs可能通过物理化学相互作用和颗粒相关效应改变贻贝对Irgarol 1051的生物学响应；Irgarol 1051与PS-MPs共暴露可能在足丝附着性能、腺体完整性及相关细胞和分子通路上产生端点依赖的交互作用。该研究旨在检验二者是否损害足丝附着性能和足丝腺完整性，共暴露是否在不同生物终点产生不同交互模式，以及足丝损伤是否与氧化损伤、细胞器功能障碍、Ca²⁺调节改变、细胞能量分配改变、足丝蛋白相关基因失调和caspase-8表达变化相关。

关键技术方法可概括为：研究人员从中国浙江嵊泗枸杞岛采集厚壳贻贝 Mytilus coruscus，实验室驯化2周后设置空白对照、DMSO溶剂对照、低/高浓度Irgarol 1051、PS-MPs及两种共暴露处理，暴露2周并每日换水再染毒；采用扫描电子显微镜、μ-FTIR和Zetasizer表征PS-MPs；以万能试验机测定足丝断裂力和斑块脱附力；采用H&E染色、Masson三色染色和透射电子显微镜评估足丝腺组织、胶原和超微结构；测定ROS、抗氧化酶、脂质过氧化、Ca²⁺、ATP酶、ATP和细胞能量分配；用qPCR检测足丝分泌相关基因和caspase-8；并以双因素方差分析、Tukey检验、Pearson相关、Mantel检验和主成分分析进行统计。

研究结果如下。

3.1 聚苯乙烯微塑料表征与足丝损伤评估：研究人员确认所用PS-MPs为球形聚苯乙烯颗粒，具有典型表面性质和粒径分布，Zeta电位为?21.66 ± 4.39 mV。扫描电子显微镜显示，对照组远端斑块完整光滑，而Irgarol 1051或PS-MPs暴露产生表面缺陷，共暴露尤其高剂量Irgarol共暴露造成最严重损伤，并显著增加足丝斑块粗糙度。足丝数量、斑块面积、累积足丝长度以及近端、中段和远端直径在暴露处理中均下降，以高剂量共暴露下降最大；Irgarol或PS-MPs单独暴露也降低这些指标，但程度较轻。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性在Irgarol和PS-MPs单独暴露下显著下降，双因素方差分析显示Irgarol × PS-MPs交互显著，共暴露下PPO下降小于Irgarol单独暴露。力学测试表明，断裂力随Irgarol浓度升高而下降，PS-MPs单独影响较小，联合处理下降更明显；斑块脱附力呈相似模式，在高剂量共暴露最低。总体表现为Irgarol 1051对足丝结构和机械性能的损害更强，PS-MPs在共暴露中调节若干附着相关响应。

3.2 足丝腺组织病理与氧化应激：组织学显示，Irgarol 1051和PS-MPs单独及联合暴露均诱导足丝腺明显病变，表现为空腔化面积比例增加，高剂量Irgarol下最严重；Irgarol单独比PS-MPs单独造成更广泛损伤，共暴露进一步加剧组织损伤。氧化应激方面，双因素方差分析显示Irgarol 1051和PS-MPs对多数终点有显著影响及显著交互。细胞内ROS在低剂量Irgarol单独和高剂量Irgarol加PS-MPs下显著升高；SOD活性和T-AOC显著降低，共暴露下降更大；CAT活性在低剂量Irgarol组升高，提示补偿反应；LPO在共暴露下轻度升高；MDA在低剂量Irgarol和共暴露组显著升高，但共暴露升高小于Irgarol单独。结果表明污染物暴露诱导足丝腺损伤和氧化扰动，高Irgarol及共暴露下组织损伤最明显。

3.3 足丝腺胶原含量与分布：Masson三色染色显示污染物暴露后胶原沉积增加，在高剂量Irgarol 1051组和Irgarol–PS-MPs共暴露组最明显。羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）测定与组织学大体一致：低剂量Irgarol暴露下HYP含量显著增加，而共暴露组HYP呈上升趋势但未达统计显著。胶原相关响应具有处理依赖性，胶原沉积增加伴随不同暴露组HYP响应变化。

3.4 足丝分泌相关基因转录变化：Irgarol 1051和PS-MPs暴露诱导贻贝足蛋白（mussel foot proteins，Mfps）和前胶原（procollagens，preCOLs）基因转录丰度显著且暴露依赖性改变。Mfp-1在所有处理中显著下调，Irgarol单独下降更大。Mfp-2在低剂量Irgarol和PS-MPs单独下上调，在高剂量Irgarol及高剂量共暴露下下调。Mfp-3在低剂量Irgarol和低剂量共暴露下上调，在高剂量Irgarol和高剂量共暴露下显著下调。Mfp-4在低、高剂量Irgarol和高剂量Irgarol加PS-MPs共暴露下显著增加。Mfp-5在Irgarol单独下上调，但在共暴露下下调，高剂量最明显。Mfp-6在低剂量Irgarol和低剂量共暴露下上调，在较高水平共暴露下下调。preCOL-P在低剂量Irgarol和低剂量共暴露下显著下降，但在高剂量共暴露下显著增加；preCOL-D在PS-MPs单独和高剂量Irgarol单独下增加，在低剂量Irgarol和共暴露下下降；preCOL-NG在低剂量Irgarol和PS-MPs单独下增加，在高剂量Irgarol单独下下降。caspase-8在Irgarol处理组显著上调，PS-MPs单独无显著变化，双因素方差分析确认Irgarol 1051主效应和Irgarol × PS-MPs交互显著。转录谱表现为处理依赖性失调，而非足丝蛋白相关基因的统一抑制；caspase-8上调主要与Irgarol暴露相关。

3.5 足丝腺超微结构改变与Ca²⁺变化：透射电子显微镜显示，对照足丝腺细胞线粒体膜完整、嵴组织良好。Irgarol 1051单独暴露呈剂量依赖性损伤：低剂量组出现局灶性外膜破裂和嵴断裂，高剂量组明显碎片化。PS-MPs单独造成相对轻微损伤，主要表现为嵴模糊。共暴露产生最严重改变，尤其高Irgarol水平下出现线粒体膜塌陷、嵴完全丢失并伴内质网损伤。定量显示所有暴露组受损线粒体比例显著高于对照，严重程度为共暴露 > Irgarol单独 > PS-MPs单独。与结构变化一致，Ca²⁺含量在PS-MPs单独和共暴露组较对照显著下降，共暴露下降最大。结果提示共暴露造成最严重的线粒体和内质网完整性破坏，并伴随Ca²⁺含量显著降低。

3.6 细胞能量代谢状态与能量分配响应：Na⁺/K⁺-ATPase活性在各处理中呈上升趋势，但与对照无显著差异，双因素方差分析显示Irgarol 1051主效应显著，无PS-MPs效应或交互。Ca²⁺/Mg²⁺-ATPase活性仅在低剂量Irgarol组显著下降，双因素方差分析显示Irgarol 1051和PS-MPs主效应及交互显著。ATP含量在低剂量Irgarol组、PS-MPs单独组和两个共暴露组显著下降，双因素方差分析显示Irgarol 1051和PS-MPs主效应及交互显著。与对照相比，蛋白含量在所有处理中显著下降，低剂量Irgarol和PS-MPs组下降最大；碳水化合物含量无显著变化；脂质在高剂量Irgarol、PS-MPs和共暴露组显著下降。可利用能量（available energy，Ea）在所有处理中显著下降，PS-MPs单独下降最大；电子传递系统（electron transport system，ETS）活性在高剂量Irgarol、PS-MPs和高剂量共暴露组显著升高，而细胞能量分配（cellular energy allocation，CEA）在这些相同处理中显著下降。结果表明污染物暴露改变细胞能量平衡，表现为呼吸补偿增加但足丝腺组织净能量可用性降低。

3.7 相关热图与主成分分析：Pearson相关分析结合Mantel检验显示，足丝数量、断裂力和脱附力均与氧化应激指标ROS、SOD、CAT、LPO、mfp-1表达和总蛋白含量显著相关。PPO活性与SOD、CAT、脂质过氧化产物MDA、mfp-3、mfp-4和caspase-8显著相关。方向上，蛋白与Ea正相关，Ca²⁺/Mg²⁺-ATPase与碳水化合物正相关，MDA与脂质、Mfp-6和Mfp-3正相关；Na⁺/K⁺-ATPase与ATP负相关，preCOL-NG与Ca²⁺/Mg²⁺-ATPase和碳水化合物负相关，mfp-2与ATP和碳水化合物负相关，MDA与preCOL-P负相关，LPO与mfp-1负相关，CAT与蛋白负相关，SOD与LPO负相关。主成分分析进一步显示，对照组与T-AOC等抗氧化能力指标正相关，而所有污染物暴露组与氧化应激变量相关并与对照明显分离。多元分析表明污染物暴露贻贝处于不同于对照的生理状态，足丝损伤与氧化、能量和分子变化密切关联。

3.8 Irgarol 1051与PS-MPs交互分析：双因素方差分析显示Irgarol 1051与PS-MPs之间存在端点依赖性交互。显著交互出现在多种足丝形态性状、斑块粘附、PPO活性、Ca²⁺含量以及多个分子和能量代谢终点，而断裂力、HYP含量和Na⁺/K⁺-ATPase活性无显著交互。对于斑块粘附、斑块面积和抗氧化指标SOD、CAT、T-AOC，共暴露产生比相应单独暴露更强的响应；对于PPO活性，共暴露下降小于Irgarol单独暴露；对于足丝直径、Ca²⁺含量和能量代谢终点，响应幅度和方向随Irgarol 1051与PS-MPs组合而变化。这些端点特异性交互模式表明，二者联合效应在不同生物响应中并不一致，共暴露对某些终点产生更强响应，而其他终点响应较弱或无显著交互。

讨论部分总结：研究人员指出，足丝是贻贝摄食、运动和附着的重要结构，远端黏附斑块提供水下黏附，对生存、避敌和群聚行为至关重要。既往研究显示，海洋酸化/升高pCO₂、缺氧、热应激或热浪以及人为噪声等可损害足丝生成和性能；微塑料也可单独或与其他胁迫因子共同损害足丝附着。足丝黏附主要依赖远端斑块中富含二羟基苯丙氨酸（DOPA）的Mfp界面膜，斑块形成或黏附化学受扰可削弱附着。本研究中Irgarol 1051和PS-MPs代表一种新的联合胁迫情景，通过协调的细胞和分子机制损害足丝完整性；Irgarol效应超过PS-MPs并呈浓度依赖性。足丝柄也决定附着强度、拉伸抗性和栖息地持续性，暴露后断裂面由不规则多层形态转向更平滑平面，提示由韧性主导转为脆性主导的失效。足丝生成和机械性能总体下降，与低盐和热浪胁迫下附着受损的报道一致。PPO介导足丝交联和硬化，Irgarol暴露后显著下降，但与PS-MPs共暴露下下降较小，提示PS-MPs依赖性地调节Irgarol响应。足丝腺是足丝生物合成和组装部位，其结构完整性是正常足丝形成和功能的前提。本研究中Irgarol 1051和PS-MPs单独及联合暴露造成足丝腺明显组织病理损伤，表现为空腔化增加，高Irgarol剂量最严重并被共暴露进一步加剧。由于足部腺体分泌细胞介导足丝蛋白和前胶原合成与分泌，组织损伤可能损害足丝生成并导致足丝形成和黏附下降。PS-MPs可能通过颗粒相关应激加重腺体损伤，包括微塑料积累、组织损伤和能量代谢扰动。氧化应激由ROS驱动，与膜氧化、脂质过氧化和抗氧化防御改变密切相关。本研究中污染物暴露扰乱足丝腺氧化还原稳态，表现为ROS产生、抗氧化防御和脂质过氧化的处理依赖性变化。腺体损伤和氧化应激与胶原重塑、Mfp和preCOL基因失调、线粒体和内质网损伤、Ca²⁺状态改变以及细胞能量可用性降低相关，这些变化可能损害正常足丝形成和黏附所需的合成、分泌、组装和固化过程。HYP作为胶原标志物，在低剂量Irgarol 1051下显著增加，提示贻贝可能增强胶原合成以对抗污染物诱导的组织损伤；共暴露组HYP呈上升趋势但未达显著，提示胶原合成与沉积动态平衡受到扰动。Masson染色显示高剂量Irgarol单独和高剂量Irgarol加PS-MPs下胶原沉积增加，与更强胶原重塑响应一致。虽然短暂胶原沉积增加可帮助组织修复，但持续过度积累可能导致细胞外基质异常或纤维化，从而改变正常足丝蛋白合成和分泌所需的腺体结构环境。分子层面，mfp-1至mfp-6与前胶原preCOL-P/D/NG构成足丝结构和功能基础：mfp-1贡献整体机械强度，mfp-3和mfp-5富含DOPA并介导界面黏附，preCOL-P/D/NG形成纤维支架。因此观察到的Mfp和preCOL基因失调与足丝结构和功能受损一致。Mfp-1形成足丝保护性角质鞘，通过DOPA–Fe³⁺配位和DOPA-醌交联起作用，在本研究中所有处理下均下调，与其抑制和足丝直径及断裂力下降一致。mfp-3和mfp-5编码富含DOPA的黏附蛋白，在高剂量Irgarol和共暴露下受抑制，与斑块黏附下降一致。mfp-2、mfp-4和mfp-6的暴露依赖性变化进一步提示DOPA-醌氧化还原平衡和交联过程受扰。胶原相关基因preCOL-P、preCOL-D和preCOL-NG的差异响应提示胁迫诱导胶原性足丝核心重塑，可能削弱足丝韧性、弹性和结构完整性。这些转录变化与足丝结构受损相关，并与细胞器损伤和ATP可用性降低同时发生。caspase-8在Irgarol暴露下显著上调，PS-MPs单独无变化；caspase-8是外源性凋亡通路的起始caspase，其转录上调提示Irgarol 1051暴露下足丝腺细胞凋亡相关信号在分子水平被激活。但本研究测定的是caspase-8 mRNA表达，而非caspase-8蛋白活性、活化caspase-3水平或凋亡细胞比例，因此caspase-8上调提示凋亡相关信号激活，但不能直接证明凋亡性细胞死亡。结合腺体空腔化、线粒体和内质网损伤、ATP耗竭和Ca²⁺调节改变，该响应提示caspase-8相关细胞死亡信号可能参与足丝腺细胞应激反应，并可能降低Mfp和preCOL合成与分泌所需分泌细胞的功能能力。透射电子显微镜显示污染物暴露后线粒体和内质网损伤，共暴露下超微结构损伤最明显。结合Ca²⁺含量和若干能量代谢变量显著交互，这些发现表明PS-MPs改变Irgarol相关细胞响应，但修改幅度和方向因终点而异。钙在足丝形成中的信号、酶调节和胶原生物合成中起核心作用，紧密Ca²⁺稳态对膜稳定和细胞外基质合成至关重要。本研究中，共暴露造成内质网损伤并伴随Ca²⁺含量显著下降，且随Irgarol浓度升高而加剧。线粒体破坏、内质网损伤、Ca²⁺耗竭和能量代谢状态改变同时出现，表明联合暴露下细胞器完整性、离子调节和细胞生物能量学存在密切关联扰动。但由于这些终点在同一暴露期内评估，无法确定其时间顺序和因果关系。Irgarol 1051与PS-MPs对足丝完整性的联合效应具有端点依赖性。双因素方差分析显示多个测量终点存在显著Irgarol 1051 × PS-MPs交互，表明这些终点对某一因素的响应取决于另一因素水平。对于斑块面积、斑块黏附、SOD、CAT、T-AOC和preCOL-D表达，共暴露产生比相应单独暴露更强的响应。对于PPO活性，共暴露下降小于Irgarol单独暴露，代表不同于其他终点的交互模式。对于断裂力、HYP含量、Na⁺/K⁺-ATPase活性、碳水化合物含量以及Mfp-3和Mfp-6表达，未检测到显著Irgarol 1051 × PS-MPs交互。这种交互模式多样性突出联合污染物效应的复杂性，并表明PS-MPs对Irgarol响应的修改是端点依赖的，而非在所有生物响应中一致。Irgarol-PS-MPs共暴露可能通过趋同毒性通路增强线粒体功能障碍。Irgarol 1051已被报道抑制电子传递链复合体III，引发ROS爆发，促进脂质过氧化和DNA损伤；升高ROS可能进一步扰乱Ca²⁺稳态并触发线粒体通透性转换孔开放，导致Ca²⁺外流和线粒体肿胀。共暴露下响应改变的一种可能解释是PS-MPs与Irgarol 1051之间载体相关物理化学相互作用；但本研究未测定Irgarol吸附到PS-MPs、颗粒在贻贝组织中的积累以及足丝腺中Irgarol浓度，因此载体介导递送机制仍是可能解释而非确认通路。颗粒相关氧化和能量应激也可能促成共暴露响应。此外，尽管每日完全换水维持了标称暴露浓度和水质，该暴露模式代表反复暴露，可能无法完全捕捉14天内PS-MPs随时间的沉降、聚集和与Irgarol的演变相互作用。污染物暴露引起有限补偿性离子调节反应。Na⁺/K⁺-ATPase活性在各暴露处理中呈非显著上升趋势，提示试图稳定Na⁺/K⁺梯度和膜电位，而非该通路明显激活；Irgarol 1051可能通过驱动ROS积累间接促进该响应。相比之下，Ca²⁺/Mg²⁺-ATPase作为细胞内Ca²⁺和Mg²⁺的主要调节者，在低剂量Irgarol下下降，表明Ca²⁺处理受扰和Ca²⁺稳态受损。细胞ATP作为通用能量货币在若干处理下显著下降，反映胁迫下能量供应不足，并可能优先将有限ATP用于即时防御响应。与这种重新分配一致，总蛋白含量在所有处理中显著下降，可能由于合成受抑和/或降解加速。细胞可能将稀缺ATP转向生产抗氧化和其他保护蛋白，而牺牲结构蛋白库。脂质含量也下降，可能由于增强脂解以满足能量需求和ROS驱动的膜脂过氧化降解，而碳水化合物水平未变，提示能量分配扰动主要影响蛋白和脂质代谢。ETS活性在多个暴露组升高，表明尝试进行生物能量补偿；但污染物诱导的ATP合酶抑制和质子动力势耗散可能降低转化效率，因此Ea仍显著下降。观察到的CEA下降表明更大比例能量被转向维持和应激防御，而非生长和繁殖。总之，Irgarol 1051和PS-MPs暴露与多个生物层级的协调变化相关。氧化损伤、足丝腺空腔化、线粒体和内质网损伤、ATP可用性降低、Ca²⁺调节改变和CEA下降，与Mfp和preCOL基因失调、PPO活性降低、caspase-8表达变化和足丝性能受损同时发生。这些相关响应为理解Irgarol 1051和PS-MPs暴露对足丝系统的多层级效应提供了整合框架。由于这些终点在同一暴露期内评估，无法从本实验设计确定其时间性和因果性关系。这些发现表明污染物暴露使足丝系统转向足丝形成、机械性能和斑块黏附降低，并伴随更严重的腺体和细胞器损伤以及细胞能量可用性降低。此类变化可能增加污染沿海和水产养殖环境中与附着相关的脆弱性。

研究结论翻译：本研究显示，暴露于Irgarol 1051和PS-MPs与厚壳贻贝 M. coruscus 足丝功能完整性受损相关。足丝机械性能降低和界面黏附下降伴随氧化应激、足丝腺损伤、线粒体和内质网损伤、ATP可用性降低、Ca²⁺调节改变以及足丝蛋白基因表达失调。双因素方差分析揭示多个端点存在显著的Irgarol 1051 × PS-MPs交互，包括斑块黏附、足丝直径、抗氧化反应、Ca²⁺含量、能量代谢和基因表达，而断裂力、HYP含量和Na⁺/K⁺-ATPase活性未显示显著交互。这些交互的幅度和方向因端点而异，表明Irgarol 1051与PS-MPs的组合效应并不一致。跨生物层级，氧化和足丝腺损伤、细胞器功能障碍、Ca²⁺含量降低、细胞能量分配改变和足丝蛋白失调与足丝性能和斑块黏附受损相关。总体而言，这些生理损害可能削弱附着能力并增加脱落风险，提示在污染物暴露下贻贝持续存在和水产养殖稳定性的潜在后果。这些发现强调在评估生态和经济重要双壳类潜在风险时，应考虑组合污染物效应的重要性。