《Brain, Behavior, and Immunity》：Anti-inflammatory IL-4 shapes the architecture of presynaptic glutamatergic puncta of human and murine sensory neurons for pain sensitivity
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白细胞介素-4（IL-4）是一种典型的多效性抗炎2型细胞因子，其在神经系统中的稳态及病理作用日益受到关注。研究人员利用人诱导多能干细胞来源的伤害感受器（iPSC-derived nociceptors，iNocs）、小鼠脊髓器官型培养切片及体内模型，系统研究了
白细胞介素-4（IL-4）是一种典型的多效性抗炎2型细胞因子，其在神经系统中的稳态及病理作用日益受到关注。研究人员利用人诱导多能干细胞来源的伤害感受器（iPSC-derived nociceptors，iNocs）、小鼠脊髓器官型培养切片及体内模型，系统研究了IL-4信号在感觉神经元突触前结构塑造及疼痛敏感性调控中的作用。研究结果显示，IL-4受体（IL4R、IL13RA1、IL2RG）在人及小鼠感觉神经元中均有表达；IL-4处理可显著增加iNocs中谷氨酸能囊泡转运体1（vGLUT1）阳性突触前扣点的数量，且该效应依赖于JAK/STAT6、蛋白激酶C（PKC）及真核翻译起始因子4E（eIF4E）等多条信号通路。转录组分析表明，IL-4上调了与突触前组织及谷氨酸能传递相关的基因表达谱。多电极阵列（MEA）记录显示，IL-4可增强iNocs的自发放电频率及相邻电极间的连续激活轨迹（CATs），提示其促进了功能性突触传递。在脊髓器官型培养切片中，IL-4显著增加了vGLUT1免疫反应性。体内研究表明，经鼻或鞘内给予IL-4可显著提高小鼠的机械性及热性痛阈，且不影响感觉运动协调能力。电生理记录进一步证实，IL-4增强了脊髓背角（SDH）神经元的兴奋性及抑制性突触传递频率，但不改变其幅度，提示其作用机制主要位于突触前。综上，该研究揭示了IL-4通过塑造感觉神经元谷氨酸能突触前结构、调节脊髓兴奋-抑制平衡，从而发挥镇痛作用的新机制，为疼痛治疗提供了潜在的新策略。
论文解读
一、研究背景与科学问题
疼痛是一种复杂的生理与病理现象，其调控机制涉及外周感觉神经元与中枢神经系统多个层面的协同作用。白细胞介素-4（IL-4）是2型细胞因子家族的代表性成员，主要由Th2细胞、2型固有淋巴样细胞（ILC2）、小胶质细胞、巨噬细胞及肥大细胞等免疫细胞分泌。既往研究已确立IL-4在免疫调节中的核心地位，但近年来其在神经系统中的稳态作用逐渐受到重视。已有证据表明，IL-4参与神经发生、突触功能调控及神经再生等过程，且在神经损伤后，IL-4分泌细胞会被招募至损伤部位以促进外周神经修复。临床上，慢性疼痛患者及小鼠模型中常观察到IL-4水平下降，而实验性过表达IL-4则可减轻神经病理性疼痛样行为。然而，IL-4介导镇痛效应的具体分子及细胞机制仍不清楚，尤其是其对感觉神经元突触前结构的直接影响尚未被系统阐明。基于此，研究人员开展了本研究，旨在利用人诱导多能干细胞来源的伤害感受器（iNocs）、小鼠脊髓器官型培养体系及体内模型，全面解析IL-4信号在感觉神经元突触前谷氨酸能结构塑造及疼痛敏感性调控中的作用与机制。
二、主要技术方法
研究人员综合运用了多种前沿技术手段。首先，利用公开的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（人GSE168243、小鼠GSE155622及GSE154659数据集）进行生物信息学分析，评估IL-4受体相关基因在不同物种及DRG神经元亚型中的表达分布，并借助NOCICEPTRA数据库查询iNocs分化过程中的基因表达轨迹。其次，采用人iPSC分化体系获得iNocs，结合免疫荧光染色与高分辨率显微成像技术定量分析vGLUT1阳性突触前扣点的形成。第三，运用药理学抑制剂（STAT6抑制剂、eIF4E抑制剂、雷帕霉素及PKC抑制剂）解析IL-4下游信号通路。第四，开展RNA测序（RNA-seq）及基因本体论（GO）富集分析，揭示IL-4处理后的转录组变化。第五，采用多电极阵列（MEA）系统记录iNocs的自发放电活动及相邻电极间的连续激活轨迹（CATs），评估功能性突触传递。第六，制备小鼠脊髓器官型培养切片（OSCs）并进行免疫组化分析。最后，通过体内行为学实验（von Frey机械痛阈测试、热板测试及转棒实验）和脊髓切片全细胞膜片钳电生理记录，评估IL-4对疼痛行为及脊髓背角（SDH）突触传递的影响。
三、研究结果
2.1 IL4R/IL2RG/IL13RA1表达与突触前谷氨酸能扣点形成
通过对人及小鼠DRG单细胞转录组数据的整合分析，研究人员发现神经元是表达I型和II型IL-4受体基因（Il4ra、Il2rg、Il13ra1）mRNA最丰富的细胞类型。跨物种比较显示，IL4R和IL13RA1在人及小鼠DRG神经元胞体中均有稳健表达，而IL2RG在小鼠中表达可检测，在人数据集中表达量极低。在iNocs分化过程中，IL4R和IL13RA1在分化早期（第5天）表达下降后逐渐回升，而IL2RG在整个过程中表达水平极低。功能实验表明，IL-4处理（20 ng/ml，24小时）不改变iNocs的细胞总数，但显著增加vGLUT1阳性突触前扣点的数量（p<0.001），且vGLUT1与神经微管蛋白TUJ1共定位良好。其他细胞因子（IL-6、TNF-α）无此效应，表明IL-4对谷氨酸能突触前结构的调控具有特异性。
2.2 IL-4调控vGLUT+/TUJ1+扣点的多条信号通路
利用NOCICEPTRA数据库分析发现，iNocs表达JAK1、JAK2、STAT6、TYK2等经典IL-4下游信号分子，以及多种蛋白激酶C（PKC）亚型。药理学抑制实验显示，STAT6抑制剂（1 μM）、eIF4E抑制剂（40 μM）、雷帕霉素（200 nM）及PKC抑制剂BIM（1 μM）均能显著抑制IL-4诱导的vGLUT1+/TUJ1+扣点增加（p<0.001），且不影响细胞存活。值得注意的是，STAT6抑制甚至使扣点数量降至未处理对照组以下，提示STAT6通路在维持基础突触前结构中亦发挥重要作用。
2.3 IL-4调控谷氨酸能突触前组织相关基因
RNA-seq分析显示，IL-4处理后有932个基因显著上调和1577个基因显著下调（p_adj<0.01）。GO富集分析表明，上调基因富集于神经元突起发育（47个基因）、轴突发生（43个基因）及突触组织（43个基因）等生物学过程；下调基因则富集于膜电位调控及钙离子跨膜转运等过程。在639个人类谷氨酸能突触相关基因中，144个上调、46个下调。上调基因包括突触前组织相关基因NRXN1、NLGN1、SYT1、STXBP1、VAMP3、CACNA2D1、PTPRD等，以及GRIA4、GRIK1等谷氨酸受体基因；下调基因包括SHANK2、GRIN2A、GRIN2B等。qPCR验证了ANGPTL4、OLFML2A、STC2等基因的显著上调。这些结果提示IL-4启动了促进突触前组织及谷氨酸能信号传递的转录程序。
2.4 IL-4增强iNocs电活动与突触传递
MEA记录显示，iNocs在分化第16天至第25天自发放电频率（MFR）极低，至第36天有所增加。IL-4处理（20、50、100 ng/ml）以剂量依赖方式显著提高MFR（p<0.001），且在补充IL-4后第5天（第30天）即可检测到显著差异。相邻电极间连续激活轨迹（CATs）的数量在IL-4处理的iNocs中于第30天和第31天显著增加，提示IL-4促进了功能性突触传递事件的发生。这些结果支持IL-4增强了iNocs的网络活动及突触连接。
2.5 IL-4增加小鼠脊髓vGLUT1免疫反应性
在小鼠脊髓背角（SDH）器官型培养切片中，IL-4处理（100 ng/ml，24小时）显著增加了vGLUT1阳性扣点的数量（p=0.027）、荧光强度（p=0.007）及体积（p=0.019）。以神经元标志物NeuN归一化后，vGLUT1免疫反应性体积仍显著增加（p=0.043）。这些结果提示IL-4可增强脊髓层面谷氨酸能突触的结构密度。
2.6 IL-4增强脊髓背角神经元兴奋性突触输入
在体内鞘内（i.t.）注射IL-4（1 μg/次，隔日一次，共5次，持续10天）后，急性脊髓切片全细胞膜片钳记录显示，IL-4显著增加了SDH浅层神经元自发性兴奋性突触后电流（sEPSCs）和微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）的频率（sEPSC：1.40±0.19 Hz vs. 3.35±0.35 Hz，p<0.001；mEPSC：0.69±0.10 Hz vs. 1.90±0.32 Hz，p<0.01），而幅度无显著变化，提示IL-4的作用机制位于突触前。此外，经鼻（i.n.）给予IL-4后，sIPSC频率显著增加（2.57±0.56 Hz vs. 0.91±0.17 Hz，p<0.01），而mIPSC频率及所有IPSC幅度均无变化，提示IL-4通过增强兴奋性驱动招募或激活了抑制性中间神经元。
2.7 IL-4降低机械及热敏感性但不影响运动协调
行为学实验显示，经鼻给予IL-4（2 μg，第1、2、3、6、8天）10天后，小鼠机械痛阈（von Frey：5.80±0.26 g vs. 7.09±0.22 g，p<0.001）及热痛阈（热板：6.22±0.40 s vs. 8.21±0.49 s，p<0.001）均显著提高，而转棒实验显示感觉运动协调能力不受影响。时间进程分析表明，机械痛阈从第5天起即显著高于盐水对照组，并持续至第10天。鞘内注射IL-4（1 μg）亦产生类似的机械痛阈升高效应，但起效较晚（第9-10天）。两种给药途径的总体效应无显著差异，提示经鼻给药是一种有效的IL-4应用途径。
四、讨论与结论
本研究通过多层次的实验体系，系统揭示了IL-4在感觉神经元突触前谷氨酸能结构塑造及疼痛调控中的新机制。研究证实，IL-4受体在人及小鼠DRG感觉神经元中均有表达，IL-4处理可促进iNocs中vGLUT1阳性突触前扣点的从头形成，该过程涉及JAK/STAT6、PKC及eIF4E等多条信号通路。转录组分析进一步表明，IL-4上调了突触前组织相关基因及谷氨酸能传递相关基因的表达。功能层面，IL-4增强了iNocs的电活动及脊髓背角神经元的兴奋性突触传递频率，同时增加了抑制性突触传递频率，提示其可能通过增强抑制性中间神经元活动、改变脊髓兴奋-抑制平衡来发挥镇痛作用。体内实验证实，IL-4可降低机械及热敏感性而不影响运动协调，且经鼻给药与鞘内给药效果相当。这些发现将IL-4从传统的免疫调节因子拓展为神经突触可塑性的重要调控因子，为理解疼痛的神经免疫交互机制提供了新视角。IL-4作为一种内源性抗炎因子，其经鼻给药的便捷性及对机械性疼痛的显著缓解作用，使其成为治疗慢性疼痛的潜在候选分子。然而，本研究所有实验均在非病理条件下进行，IL-4在炎症性或神经病理性疼痛模型中的镇痛效果及机制仍需进一步验证。此外，脊髓中多种细胞类型（神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞）均表达IL-4受体，其在体内镇痛效应中的具体细胞贡献尚需通过细胞类型特异性敲除等策略加以阐明。
