耐汞植物生长促生菌新种Neobacillus phytotutelans sp. nov.的分离与表征及其对白羽扇豆（Lupinus albus）植物保护的作用

《Applied Soil Ecology》：Neobacillus phytotutelans sp. nov.: a mercury-tolerant plant growth-promoting bacterium associated with phytoprotection in Lupinus albus

　　

本研究报道了从西班牙阿尔马登矿区汞（Hg）污染根际土壤中回收的菌株C211的分离、表征及拟议新种描述，命名为Neobacillus phytotutelans sp. nov.。与所有29个有效发表的Neobacillus物种的模式菌株基因组进行比较，最高数字DNA-DNA杂交（digital DNA-DNA hybridisation，dDDH）值为32.5%，最高平均核苷酸一致性（average nucleotide identity，ANI）为85.92%，两者均远低于物种划分通常采用的70%和95–96%阈值；这些结果连同该菌株在基因组尺度系统发育中作为一个独立的、最大支持分支的位置，支持菌株C211与该属所有有效发表成员在物种水平上的分化。以白羽扇豆（Lupinus albus）在三种汞污染土壤（116.6–192.7 mg·kg^?1）中进行的盆栽试验表明，接种C211的植物生物量高于相应的未接种对照，并伴随终点特异性的组成差异以及所分析植物组织中较低的总汞浓度。EcoPlate分析显示与接种相关的底物利用差异，尤其在S1和S2土壤中的碳水化合物和氨基酸类别。群落敏感性测定显示，在可培养土壤微生物部分中，若干抗生素（尤其是β-内酰胺类）的最低抑制浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）较低。这些观察结果并未建立直接的细菌机制、土壤中汞的去除，或抗生素抗性基因丰度与传播的变化。总体而言，这些发现将C211确定为一个有前景的候选生物接种剂，有待进一步研究，其与植物保护、植物组织中较低的总汞浓度以及在所测条件下群落水平表型抗生素耐药性的降低相关。

**研究背景与问题**

重金属污染是全球持续关注的环境问题，汞（Hg）作为高毒性金属，可在环境中长期存留并对生态系统和人体健康造成威胁。西班牙阿尔马登矿区是全球最重要的汞富集区之一，超过2000年的采矿活动导致该地区土壤严重汞污染，不适宜农业活动，亟需经济有效的修复技术。植物修复（phytoremediation）是一种广泛接受且经济可行的策略，但汞胁迫会诱发活性氧（reactive oxygen species，ROS）积累，抑制植物生长。利用植物生长促生菌（plant growth-promoting bacteria，PGPB）可增强植物的修复能力和耐受性，然而单一细菌的基因组潜力和表型效应之间的关联及其对土壤微生物群落功能的影响仍需深入评估。基于此，本研究从汞污染根际土壤中分离菌株C211，拟通过多相分类学明确其分类地位，并以白羽扇豆（Lupinus albus）为植物模型，评价其促进植物生长和降低植物组织汞积累的潜力，同时在“同一健康”（One Health）背景下考察接种对根际微生物群落组成、底物利用谱和群落表型抗生素耐药性的影响。

**研究内容与方法概述**

研究人员对菌株C211开展了全面的多相分类学表征，包括生化试验、脂肪酸甲酯（fatty acid methyl ester，FAME）谱分析、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）、透射电子显微镜（TEM）观察，以及全基因组测序与组装。基于基因组数据，计算了dDDH和ANI，构建了基因组尺度系统发育树，并与所有29个有效发表的Neobacillus物种模式基因组进行了比较。功能基因组注释结合了RAST、Prokka、Bakta等工具，并利用PIFAR和PGPT-Pred预测与植物互作及促生相关的基因。盆栽试验在三种不同汞浓度的土壤中进行，植物材料为白羽扇豆品种Dorado（种子由西班牙Finca La Orden-Valdesequera农业研究所提供），土壤采自阿尔马登矿区三个地块。接种处理组与未接种对照组各设27个生物学重复。研究还通过Biolog EcoPlate^TM分析根际微生物群落底物利用多样性，采用16S rRNA基因扩增子测序评估群落结构，并利用cenoantibiogram测定评估群落水平抗生素耐药性表型。植物组织中总汞含量通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定，土壤总汞含量采用Lumex RA-915原子吸收光谱仪分析。

**主要研究结果**

*3.1 表型与化学分类学表征*

通过生化试验和显微镜观察，菌株C211呈革兰氏阳性、杆状、可运动、不产内生孢子，过氧化氢酶和氧化酶阳性，能水解淀粉和酪蛋白，发酵葡萄糖而不发酵乳糖。其表型特征组合与相近的Neobacillus物种存在差异。FAME谱以支链脂肪酸为主，其中anteiso-C_15:0（49.5%）和iso-C_15:0（23.8%）占主导，符合属级化学分类学特征。MALDI-TOF MS未能获得物种级鉴定结果，提示其蛋白谱在现有数据库中缺乏对应。TEM显示典型的芽孢杆菌形态，胞质内含电子透明包涵体和电子致密颗粒。

*3.2 基因组学与系统发育学表征*

全基因组组装获得5,885,233 bp的草图基因组（177条contig，GC含量38.5%），测序深度约76×。dDDH分析显示菌株C211与所有参考基因组间最高值为32.5%（与N. drentensis），ANI最高值为85.92%，均远低于物种划分阈值。基因组尺度系统发育树中，C211形成一个独立分支，以100%自展支持率与N. drentensis呈姊妹关系。功能注释鉴定到连续的汞抗性位点（含merA、merP、merT、merR1和烷基汞裂解酶），以及多种与金属稳态、抗生素抗性、植物促生和生物膜形成相关的基因。属特异性保守特征插入缺失（CSIs）分析显示，17个Neobacillus属诊断性CSIs中有11个存在于该菌株。

*3.3 植物生物学效应*

在三种汞污染土壤中，接种C211均显著提高了白羽扇豆的总鲜重和地上部生物量，尤其在低汞和中汞土壤中效果显著，根长和茎长也显著增加。营养组分析显示，接种植物中钙（Ca）浓度在三种土壤中均一致升高，磷（P）在中汞土壤中显著升高。探索性植物保护指数（Phytoprotection Index，PI）在S1和S2土壤中呈负值，主要受可提取糖降低驱动，但矿质元素域和脂肪酸域呈正向对比。抗氧化酶活性呈汞浓度依赖性变化：过氧化氢酶在中汞土壤中显著升高，愈创木酚过氧化物酶在高汞土壤中显著升高，而Cu/Zn-超氧化物歧化酶在低汞土壤中显著降低。植物组织中总汞含量在接种后显著降低，S1和S2土壤中分别由3996降至1990 mg·kg^?1和由49,073降至14,087 mg·kg^?1，但S3土壤中降幅较小。

*3.4 根际土壤微生物群落响应*

cenoantibiogram分析显示，接种C211后，土壤可培养微生物群落对β-内酰胺类抗生素（特别是阿莫西林/克拉维酸和头孢噻肟）的最低抑制浓度（MIC）显著降低，在低和中汞土壤中平均降幅约98%，高汞土壤中约91%。Biolog EcoPlate分析显示，在中等汞浓度下，接种处理维持了碳水化合物和氨基酸类底物的高利用率，而羧酸类底物的利用在各处理中均较低。16S rRNA扩增子测序显示，α多样性在接种与未接种土壤间无显著差异；β多样性分析中汞水平解释了63.3%的群落组成变异（未达显著），接种因素未显著影响整体群落结构。ANCOM-BC差异丰度分析识别出12个科在接种土壤中相对丰度改变，其中11个降低（如Spirosomaceae、Pseudomonadaceae）而候选科TK10升高，但该结果仅具探索性。

**讨论与结论**

讨论部分强调，菌株C211的分类地位主要由基因组物种分化指标（dDDH、ANI及基因组尺度系统发育）确立，表型与化学分类学数据作为支持性证据。基因组功能预测仅代表潜在的分子机制，未经验证，观察到的植物和土壤响应被谨慎描述为“与接种相关”而非直接因果效应。钙的一致升高被关注为可能参与胁迫信号响应的候选指标。汞抗性位点位于含前噬菌体区域，但其移动性未被证实。在“同一健康”视角下，接种后群落表型抗生素耐药性降低具有生态学意义，但不代表抗性基因丰度变化。结论部分可翻译为：1. 基于基因组分化证据（最高dDDH 32.5%、最高ANI 85.92%），菌株C211被提议为新种Neobacillus phytotutelans sp. nov.，支持其与所有有效发表Neobacillus物种的种级分化。2. 在汞污染土壤盆栽试验中，接种C211与白羽扇豆生物量及饲草品质的保持相关，支持其作为候选生物接种剂进行进一步评估，但因未追踪菌株持久性，无法确认持续定殖或区分直接细菌活性与间接根际介导效应。3. 群落水平代谢分析和cenoantibiogram表明，接种与汞胁迫下底物利用的维持及对若干抗生素（尤其β-内酰胺类）表型敏感性的增加相关，是否伴随抗性基因丰度变化需基因和可移动元件分析。4. 基因组注释鉴定了与汞和金属稳态、植物促生性状及抗生素抗性相关的决定子，但均为基于同源性预测的基因组潜力，未进行表达或活性测定，机制的建立和菌株应用评估需基因表达、汞形态与生物可利用性测定、菌株特异性持久性监测及田间条件验证。