轻量级可解释深度学习用于血蚶Anadara granosa血红蛋白无试剂定量

《Aquaculture Reports》：Lightweight and interpretable deep learning for reagent-free hemoglobin quantification in blood clam Anadara granosa

　　

血蚶Anadara granosa在商业双壳贝类中因异常高的血红蛋白（hemoglobin, Hb）含量而显著，这提供了丰富的生物可利用血红素铁来源，并构成与其产品质量相关的深红色血淋巴色泽的基础。传统分光光度法定量需要实验室基础设施和化学试剂，限制了其在高通量筛选和现场育种项目中的应用。在本研究中，研究人员开发了一种无试剂的卷积神经网络（convolutional neural network, CNN）（Hb-CNN），用于直接从数字血淋巴图像估计血红蛋白浓度。血红蛋白浓度与CIELAB颜色参数强相关，为基于图像的预测提供了比色基础。优化后的Hb-CNN实现了低预测误差（平均绝对误差（mean absolute error, MAE）= 0.88 g/L），同时保持紧凑架构，参数少于3百万且约0.5 GFLOPs（giga floating-point operations），展示了预测准确性与计算效率之间的良好平衡。SHAP（Shapley Additive Explanations）分析进一步揭示，模型预测主要由亮度（L^*）和红度（a^*）驱动，其贡献与Beer–Lambert光学原理预期的浓度依赖性光衰减以及血红蛋白固有光学特性一致，从而为模型决策提供了物理化学可解释基础。独立验证显示与分光光度测量高度一致（决定系数（coefficient of determination, R²）= 0.86）。图形界面（graphical user interface, GUI）进一步支持快速批处理和血红蛋白估计。总体而言，轻量且可解释的Hb-CNN为血红蛋白表型分析提供了实用的无试剂框架，在海鲜质量评估和选择育种中具有潜在应用。

该论文作者为Chuanxu Zhang、Zhou Zhang、Hongxing Liu、Chenteng Du和Yongbo Bao。研究背景与问题：产品质量常通过感官属性和营养成分评价，颜色是影响消费者感知和购买决策的重要因素，血红素蛋白的特征色泽可作为新鲜度和氧化状态的视觉指标；营养质量则依赖必需微量营养素的生物可利用度，尤其血红素铁的吸收效率远高于非血红素铁。血红蛋白（hemoglobin, Hb）和肌红蛋白（myoglobin, Mb）既承载高生物可利用度血红素铁，又作为色素参与组织着色。血蚶Anadara granosa是印度-太平洋地区特别是中国和东南亚广泛养殖的商业双壳贝类，其区别于多数商业双壳贝类的特点是具有红细胞和异常高的血红蛋白浓度，血红素铁含量高，并形成深红色血淋巴。因此，准确量化血红蛋白不仅对营养评价重要，也对产品分级和标准化质量评估重要。传统Hb定量方法如HiCN或SLS检测依赖试剂化学转化形成稳定比色复合物，试剂依赖性强，不适合快速高通量筛选。基于血红素色素与CIELAB颜色参数关联的快速光学分析可行，但全局比色描述符只总结平均颜色响应，不保留空间信息，也可能不能充分表示图像通道间非线性相互作用；高光谱成像虽可捕获更多细节，但成本高、系统复杂，限制常规或大规模部署。卷积神经网络（convolutional neural network, CNN）可从低成本RGB图像中提取图像特征，已用于人指甲、视网膜、眼睑结膜等图像血红蛋白估计和贫血筛查，也用于牛肉、猪肉、鱼、虾蟹等食品质量评估。然而，轻量、基于RGB的深度学习用于水产产品，特别是量化血蚶中与营养价值和血淋巴颜色相关的血红蛋白生化性状，仍属欠探索领域。该研究目标是开发并验证一种深度学习模型，利用低成本RGB成像系统快速、无试剂地量化血蚶血红蛋白，具体包括：建立常规比色描述符与参考SLS-Hb值的定量关系；开发并评估轻量CNN用参考SLS方法进行定量Hb预测；利用SHAP理解驱动预测的关键图像特征。最终目标是为海鲜质量评估、高通量表型和育种选择提供实用快速工具的概念验证。

关键技术方法概括：样本队列来源为200只健康成年血蚶Anadara granosa，采自中国浙江宁波沿海养殖场，分2024年10月、11月、12月和2025年2月四批，每批50只；独立验证队列为50只，采自同一养殖场2026年4月。采集50 μL血淋巴于透明10 mm聚苯乙烯网格，定制灯箱漫射LED（6000 K），Nikon Z30固定曝光，每个体10张重复图像。参考Hb用SLS-Hb（sodium lauryl sulfate hemoglobin colorimetric assay，十二烷基硫酸钠血红蛋白比色法）于540 nm测定。图像预处理包括白平衡、HSV双红hue mask分割、ROI（region of interest，感兴趣区域）64×64、训练集增强及RGB转CIELAB。开发Hb-CNN（改编LeNet-5，三卷积块加MLP（multilayer perceptron，多层感知机））、ResNet-18回归、YOLO-like和U-Net；采用MSE损失、Adam优化、早停、个体水平划分防泄漏和五次初始化集成，以R²、MAE、RMSE、bootstrap及THOP评价，并用SHAP GradientExplainer解释，进行独立时间验证、Bland–Altman分析和Flask/PyTorch图形界面部署。

研究结果：
3.1 血红蛋白浓度分布与比色相关性：通过200只血蚶的血红蛋白浓度分布和CIELAB颜色参数相关性分析，Hb浓度近似正态分布，均值±SD = 19.97 ± 4.33 g/L；K–S检验p > 0.05。代表血淋巴液滴颜色从低Hb浓度（11 g/L）的淡粉色过渡到高浓度（30 g/L）的深红色，符合较高Hb浓度下光衰减增加。Pearson相关分析显示，Hb水平与a^*（r = 0.59）和b^*（r = 0.69）正相关，与L^*（r = –0.59）和白度指数（r = –0.57）负相关，均p < 0.001；色相角和ΔE相关性弱或不显著。血蚶具有红细胞和胞内血红蛋白，其血红蛋白光谱具有血红素相关Soret和Q吸收带。该结果表明Hb浓度与血淋巴光学及颜色性质密切关联，为后续图像预测提供比色基础。

3.2 模型性能比较与对比评估：通过训练四种CNN模型并与线性回归基线比较，Hb-CNN表现出稳定收敛，训练与验证损失无明显分歧；ResNet-18中等收敛但验证损失波动；YOLO-like和U-Net训练波动较大。单特征线性回归中b^*表现最好（R² = 0.47，MAE = 2.58 g/L，RMSE = 3.14 g/L），联合L^*、a^*和b^*的多元线性回归有所改善（R² = 0.51，MAE = 2.51 g/L，RMSE = 3.02 g/L）。所有CNN模型预测性能更高，Hb-CNN最佳（R² = 0.93，MAE = 0.88 g/L，RMSE = 1.10 g/L），其次为YOLO-like（R² = 0.90，MAE = 1.04 g/L）。相对最佳线性基线，Hb-CNN的MAE和RMSE分别降低64.9%和63.6%。Hb-CNN参数少于3百万，约0.5 GFLOPs，远少于ResNet-18的超过12 M参数。其三卷积块提取低层颜色和纹理信息，再经多层感知机回归。YOLO-like性能相近但模型复杂度更高，U-Net回归准确率较低。结论是紧凑、任务特定的卷积架构在标准化成像条件下为血红蛋白估计提供了预测准确性和计算需求之间的有效平衡，支持快速血红蛋白测量和育种高通量表型应用。

3.3 SHAP分析可解释性：通过SHAP分析量化CIELAB输入通道及其空间信息对模型输出的贡献，平均SHAP归因识别L^*为主导贡献者，其次为a^*，b^*贡献相对较小。尽管b^*具有最强单变量相关性，但这与SHAP中L^*和a^*占主导不冲突：Pearson相关衡量单个变量与Hb浓度的边际线性关联，而SHAP估计各特征在拟合多变量预测模型中的贡献；b^*的部分Hb相关信息可能与其他CIELAB通道冗余。L^*和a^*占主导与含血红素色素的光学行为一致：色素浓度增加通常增加光衰减并降低图像亮度，低L^*值与预测Hb的正SHAP贡献相关，a^*增加与更高预测相关，表明模型主要捕获血淋巴逐渐变暗和变红。已有实验研究显示L^*与色素相关光衰减强关联，a^*与氧合肌红蛋白红色分量相关，肌红蛋白浓度增加与L^*降低有关；血蚶中Hb浓度与血颜色强度相关，其血红蛋白具有Soret和Q吸收带。总体而言，SHAP归因模式与Hb-CNN优于传统比色回归一起表明，模型整合了多个相关色度和光学信号，而非依赖单一颜色–Hb关系，L^*和a^*的主导作用与已知血红蛋白相关光学变化一致，为模型预测提供物理化学有意义的解释，并支持Hb-CNN作为标准化成像条件下定量血红蛋白表型的紧凑图像方法。

3.4 外部验证与系统部署：通过独立队列50个个体在2026年4月采集并采用相同标准化成像条件验证，Bland–Altman分析显示平均偏差为0.01 g/L，95%一致性界限（limits of agreement, LoA）为–4.49至4.51 g/L，96%观察值落在一致性界限内。独立时间验证得到R² = 0.86，MAE = 0.88 g/L，支持标准化成像条件下良好预测性能和低平均偏差。该性能与其他人生物环境中基于图像的血红蛋白估计相当，但直接数值比较应谨慎，因为样本类型、成像几何、参考方法和验证设计差异会明显影响报告性能。由于该方法分析提取的血淋巴而非完整组织中的血红蛋白相关信号，若干组织相关光学效应预计减少，但该潜在优势未在当前研究中直接量化。相比高光谱成像系统，RGB成像需要更简单仪器和更低数据处理复杂度，便于标准化条件下实际部署；模型建立后，常规图像Hb估计不需要化学试剂，可减少筛选中的试剂消耗。为促进食品质量筛选应用，研究人员开发了基于Python的图形界面，支持快速批次评估，可同时渲染原始图像和预测Hb浓度，系统在数秒内可批处理最多24个个体，实现不同血红蛋白水平个体的快速筛选而无需常规化学分析。局限在于模型开发样本虽来自四个独立批次，独立验证队列也单独采集，但所有个体均来自单一养殖场，因此结果支持标准化成像条件下跨独立采样期的时间稳健性，但未建立跨生产地点的地理普遍性；所有图像均使用同一相机和标准化照明系统，未来研究应包括多地点、多季节采样，并使用适当颜色校准或图像归一化评估跨设备和可变照明性能。

讨论部分总结：该研究讨论强调，Hb-CNN在标准化成像条件下实现了低预测误差、紧凑架构和与血红蛋白光学特性一致的SHAP解释，独立时间验证支持方法的时间稳健性；同时指出单养殖场来源、固定相机和照明条件限制更广泛泛化，未来需多地点、多季节、跨设备和可变照明验证。研究结论翻译：本研究建立了无试剂RGB成像方法用于血蚶血淋巴中血红蛋白的定量估计。提出的Hb-CNN以紧凑架构实现了低预测误差，SHAP分析显示预测主要与L^*和a^*相关，与血红蛋白相关光衰减和血淋巴红度变化一致。使用独立收集队列验证支持标准化成像条件下该方法的时间稳健性。在更多样化生产和成像条件下进一步验证将有助于评估该方法的更广泛适用性。总体而言，这些发现表明血淋巴光学特性为快速图像Hb估计提供了实用基础，并支持该方法在海鲜质量评估和育种项目高通量表型中的潜在应用。