《Analytical Biochemistry》：Simultaneous detection of RNA and DNA from pathogens with hyperplex PCR
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研究人员开发并评估了一种针对RNA病毒、细菌及寄生虫的16重超多重PCR（hyperplex PCR, hpPCR）检测方法，该方法能够同时检测病原体的RNA和DNA。hpPCR技术将初始逆转录步骤纳入流程，从而支持DNA与RNA的平行检测，其检测原理基于锁式
研究人员开发并评估了一种针对RNA病毒、细菌及寄生虫的16重超多重PCR（hyperplex PCR, hpPCR）检测方法，该方法能够同时检测病原体的RNA和DNA。hpPCR技术将初始逆转录步骤纳入流程，从而支持DNA与RNA的平行检测，其检测原理基于锁式探针（padlock probes）与滚环扩增（rolling circle amplification, RCA），结合纳米像素（nanopixels）荧光标记与显微镜成像实现单分子计数。研究结果显示，该16重hpPCR方法在选择性方面表现优异，未观察到假阳性信号或交叉反应；其各靶标的检出限（limit of detection, LOD）与采用相同引物对的单重qPCR/RT-qPCR相当。此外，以土壤腐殖酸作为模型抑制剂评估方法耐受性时发现，hpPCR对抑制剂具有较高的耐受能力，其中对细菌靶标的耐受性尤为突出。研究人员认为，在疾病暴发场景下，hpPCR作为一种快速多重病原体检测工具具有潜在应用价值，可作为RT-qPCR、qPCR及测序方法的替代或补充方案。
# 论文解读：面向食源性与水源性病原体暴发场景的16重超多重PCR检测方法研究
## 研究背景与问题
病原体的快速、可靠鉴定在医疗卫生领域具有关键意义，尤其在疾病暴发控制中至关重要。现有基于PCR和测序的分子检测方法各有利弊：实时定量PCR（qPCR）灵敏度高、周转时间短，但多重检测能力受限于仪器荧光通道数量，通常仅能同时检测2至6个靶标；数字PCR（dPCR）可实现超灵敏检测，但多重并行分析能力同样有限。基于毛细管电泳的多重PCR虽可检测十种以上细菌，但操作复杂。宏基因组测序及16S rRNA基因测序虽能无偏检测样本中所有微生物，但耗时且依赖生物信息学能力。因此，亟需一种能够在单次反应中同时检测多达数十种不同病原体、且兼具速度和选择性的方法，以应对成分未知的食品和环境样本中病原体的快速筛查需求。
## 研究内容与核心方法
研究人员开发并系统评估了首个针对胃肠道病原体的16重超多重PCR（hyperplex PCR, hpPCR）方法，靶标涵盖RNA病毒、细菌和寄生虫，其中包括高致病性细菌炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）和鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）。对于部分细菌，同时纳入属水平和种水平检测引物，以拓宽并行检测能力。研究将hpPCR的检出限（LOD）与使用相同引物对的单重qPCR/RT-qPCR进行比较，并以腐殖酸作为模型抑制剂评估方法的抑制物耐受性。
hpPCR方法包含五个主要步骤：（1）RNA或DNA的（逆转录）PCR扩增；（2）锁式探针（padlock probes）连接；（3）连接产物的捕获与滚环扩增（rolling circle amplification, RCA）；（4）纳米像素（nanopixels）标记；（5）荧光显微镜成像与图像分析。实验所用试剂盒由Aplex Bio（Solna, Sweden）提供。样本方面，细菌DNA使用BioRobot EZ1及EZ1 DNA Tissue Kit提取，寄生虫DNA使用DNeasy Power Soil Kit提取，病毒RNA依据ISO 15216-1:2017标准使用Egene-up提取。研究中涉及的所有菌株和毒株均来源明确且经过充分表征。
## 主要研究结果
### 选择性
研究人员对11种目标细菌、1种寄生虫和4种病毒进行了选择性测试。结果显示，除耶尔森菌属检测外，所有预期阳性靶标均产生了高RCA计数信号。然而，小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）在属水平检测中呈阴性，BLAST分析表明所采用引物仅与鼠疫耶尔森菌对应基因完全匹配，而与小肠结肠炎耶尔森菌仅部分匹配，提示该属水平引物需重新设计。非产志贺毒素大肠杆菌和蒙戈病毒（Mengovirus）的阴性结果符合预期，阴性对照亦无信号。在高浓度RNA/DNA测试条件下，所有细菌、寄生虫和病毒均未出现假阳性信号或交叉反应，表明该方法选择性较高。此外，研究指出核酸提取方案的选择会影响病原体检测的选择性，例如革兰氏阴性菌更易裂解可能引入偏差，因此在暴发调查中应使用广谱裂解方法。
### 检出限（LOD）比较
将16重hpPCR与单重qPCR/RT-qPCR的LOD进行比较，结果显示大多数靶标的LOD相当。其中7个细菌检测靶标（Brucella abortus、Yersinia属、Yersinia pestis、Coxiella burnetti、Francisella tularensis、STEC stx1和STEC stx2）的LOD与qPCR一致；qPCR在Bacillus属和Salmonella属两个靶标上表现略优，而hpPCR在Bacillus anthracis和Brucella属上表现更好。病毒靶标方面，甲型肝炎病毒和诺如病毒GII的LOD与RT-qPCR一致，诺如病毒GI的RT-qPCR表现略优。研究同时指出，部分靶标的绝对基因组拷贝数可能因定量方法存在高估情况。
### PCR抑制物耐受性
以腐殖酸作为模型抑制剂，研究人员发现不同DNA靶标对抑制物的反应存在显著差异。例如，Salmonella检测在500 ng腐殖酸时即失败，而鼠疫耶尔森菌在1500 ng时仍不受影响。进一步将表现最佳的检测与qPCR/RT-qPCR不同预混液进行比较：hpPCR对鼠疫耶尔森菌在2500 ng腐殖酸时仍可获得阳性结果，但Yersinia属和STEC在2000–2500 ng时受到显著抑制。诺如病毒GII在500 ng时即受影响，1500 ng时完全抑制，这可能是由于逆转录反应增加了流程复杂性。在qPCR中，PerfeCTa Toughmix对Yersinia属的耐受性可达1500 ng，与hpCR相当，而PerfeCTa Multiplexmix对所有细菌靶标在500 ng时即失效。RT-qPCR中，TaqPath预混液对腐殖酸的耐受性显著高于hpPCR，而Path-ID预混液的表现与hpPCR相近。研究表明，hpPCR的抑制物耐受性与已建立的商业qPCR/RT-qPCR预混液总体相当，且可通过更换逆转录酶、DNA聚合酶或提高引物浓度进一步改善。
## 结论与讨论
总体而言，研究人员开发的16重hpPCR方法在LOD方面与已确立的单重qPCR/RT-qPCR相当，但具备同时检测多个RNA和DNA靶标的独特优势。该方法对所有预期物种均能检出，且未观察到交叉反应或假阳性。与qPCR/RT-qPCR相比，hpPCR的主要优势在于其多重检测能力——单次反应即可覆盖多种DNA和RNA病原体，从而简化检测流程。若样本怀疑含有特定病原体，qPCR/RT-qPCR可能更快；测序方法虽可提供更详细的遗传信息，但耗时更长。因此，hpPCR可作为初步筛查工具，在需要进一步分辨率时辅以测序，从而填补快速简便的qPCR分析与复杂测序方法之间的空白。本研究开发的16重hpPCR为在成分未知样本中进行广谱病原体检测提供了概念验证，但其诊断性能尚未经过临床评估，需进一步方法验证后方可用于临床场景。未来hpPCR可扩展至最多100个靶标，例如纳入更多目标病原体的属水平和种水平检测，从而在疫情暴发情境下实现多种微生物（细菌、寄生虫和病毒）的快速选择性检测与鉴定，有助于限制疾病传播并促进患者及时获得适当治疗。
