以干组分替代玉米青贮型全混合日粮（TMR）对育肥公牛瘤胃健康、颊部与粪便微生物组及血浆代谢组的影响

《animal》：Replacing corn-silage in total mixed rations for fattening bulls with dry components: Effects on rumen health, the buccal and faecal microbiome and the plasma metabolome

　　

育肥公牛饲喂干全混合日粮（total mixed ration, TMR）与饲喂基于玉米青贮的日粮生长相同。所有公牛临床健康相同，但饲喂干日粮的公牛瘤胃壁更厚。颊拭子特征和微生物多样性反映日粮影响。血浆代谢组提示饲喂干日粮的公牛代谢健康受损。生产性能和临床检查不能全面反映动物健康。基于替代性饲料（如甜菜渣青贮、秸秆或精料等副产品）的育肥公牛日粮可实现相当生长速度，但与基于玉米青贮的日粮相比，在纤维组成和颗粒大小等方面存在差异。然而，在代谢和瘤胃健康方面，此类干日粮显示出适应性有限的警示信号：公牛瘤胃壁厚度增加、血浆代谢组受损和微生物组成改变，提示健康受损。为全面评估反刍动物日粮的适宜性，不仅应考虑生产性能和缺乏临床明显障碍，还应考虑代谢和瘤胃健康。

研究背景与问题：在育肥公牛中，日粮养分含量、颗粒大小及不同饲料比例决定生长性能和动物健康。能量密度和可消化碳水化合物供应可提高短期增重；日粮颗粒大小和物理结构影响咀嚼、瘤胃条件和消化率，也是降低亚急性瘤胃酸中毒（subacute rumen acidosis, SARA）风险的重要因素。实践中许多公牛日粮以玉米青贮、秸秆、谷物和蛋白源为主。替代饲养策略试图将草、秸秆或副产品等饲料纳入日粮，以应对气候变化下饲料供应问题。但即使配制为等能和等氮并供应足量纤维，有效纤维和颗粒大小仍可能不同。Koch et al. 在配套研究中发现，饲喂常规玉米青贮型日粮与饲喂基于秸秆、谷物和糖甜菜副产品的干TMR的西门塔尔（Simmental）公牛生长率相似且较高；两种日粮差异主要在CONVL含玉米青贮而DRY不含，DRY使用较高比例小麦秸秆以提供纤维，导致颗粒大小、纤维组成和采食量差异。日粮和采食差异可影响胃肠道微生物组和循环代谢组；能量和蛋白密集日粮可损害瘤胃微生物组、危害肠道健康并促进促炎代谢表型，且可能不立即表现。该研究扩展Koch et al.的配套研究，假设两种等能等氮但颗粒大小和纤维组成不同的日粮会产生不同的胃肠道微生物和血浆代谢谱，即使原试验生长性能无差异。研究人员通过16S核糖体RNA（16S ribosomal RNA, 16S rRNA）基因测序表征颊拭子和粪便微生物群落，用pH和超声评估瘤胃适应，并结合靶向血浆代谢组学，识别日粮相关代谢特征，以补充描述两种日粮下育肥公牛的胃肠道和代谢后果。

研究人员开展的研究与意义：研究使用同一批动物样本，24头西门塔尔育肥公牛随机接受常规（CONVL）或干（DRY）TMR。结果显示，两种日粮支持相似生长性能，但DRY公牛出现代谢和瘤胃健康受损迹象：瘤胃壁厚度增加、蠕动降低、瘤胃内容物分层减少；血浆代谢组中三甲胺 N-氧化物（trimethylamine N-oxide, TMAO）和甲硫氨酸亚砜升高，马尿酸和3-吲哚丙酸（3-indolepropionic acid, 3-IPA）降低，提示广泛日粮相关代谢特征、潜在氧化应激和有益代谢物含量降低；颊部微生物多样性降低，反映饲料类型差异。其意义在于，生产性能和临床无病不能全面反映动物健康，评估反刍动物日粮适宜性还需纳入代谢和瘤胃健康。

关键技术方法：实验在德国Hofgut Neumühle教育与动物饲养研究中心开展，时间为2020年12月至2021年9月。样本队列来源为Koch et al.配套研究中的同一动物队列：24头西门塔尔育肥公牛随机分配CONVL或DRY TMR，日粮按NRC推荐配制。研究每月记录体重和健康，并在第28、32、36、40周进行临床检查、体况评分、跛行、尾尖坏死、背膘厚度和瘤胃超声；安装Smaxtec瘤胃bolus以10分钟间隔自动测量瘤胃pH。第28和40周采集EDTA颈静脉血浆，使用MxP? Quant 500 kit进行靶向代谢组学，结合液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）和流动注射分析-串联质谱（flow injection analysis-tandem mass spectrometry, FIA-MS/MS）。第40周采集颊拭子和直肠粪便，提取DNA，对16S rRNA基因V3-V4区测序，使用MICCA流程推断扩增子序列变体（amplicon sequence variant, ASV），以SILVA132数据库分类，并在MicrobiomeAnalyst中分析。统计使用线性混合模型、MetaboAnalyst和MicrobiomeAnalyst。

研究结果：
生长性能与动物健康：通过前期Koch et al.报告及本研究临床、超声和pH数据，日粮等能等氮，但DRY含更多小颗粒；DRY公牛非纤维碳水化合物和糖摄入更高，鲜物质、干物质、代谢能和不溶性纤维包括物理有效中性洗涤纤维（physically effective neutral detergent fiber, peNDF）摄入较低；木质素和淀粉摄入无差异；生长性能高（1.8 kg/d）且两组相当。临床检查中，体况评分和背膘厚度不受日粮影响，CONVL背膘厚度有增加趋势（P = 0.053，平均高10%）。瘤胃相关评估显示，CONVL瘤胃内容物分层更明显，瘤胃噪声更频繁更强；DRY瘤胃壁厚度更大，包括黏膜和黏膜下层厚度及整个瘤胃壁厚度。步态正常；尾尖坏死评分随时间变化但无组间差异。瘤胃pH从第5至26周无组间差异，但平均pH低于5.8超过5 h/天。结论是两组临床健康相同，但DRY公牛瘤胃壁增厚、蠕动和分层降低，提示瘤胃健康受损。

代谢组学分析：通过靶向代谢组学，第28周和第40周血浆分别检测到478和287种化合物。主成分分析（principal component analysis, PCA）显示两时间点DRY与CONVL分离，前两个主成分分别解释38.9%和50%方差。火山图显示，第28周DRY公牛马尿酸、3-IPA、磷脂酰胆碱（phosphatidylcholines, PC）PC ae C38:0、PC aa C36:6、PC ae C38:1、PC aa C32:2及胆固醇酯（cholesterol esters, CE）CE18:3、CE17:1下调；TMAO、甲硫氨酸亚砜和5种甘油三酯（triglycerides, TG）TG18:2_36:3、TG18:2_36:1、TG18:2_36:2、TG18:1_38:5、TG14:0_34:2上调。第40周DRY公牛马尿酸、3-IPA、PC aa C36:6、PC ae C38:0、PC aa C40:3、PC aa C32:2、CE18:3、CE20:5、CE17:1和一个TG20:0_34:1下调；TMAO和20种TG，例如TG18:1_36:4、TG18:1_36:3和TG18:1_34:2上调。结论是DRY血浆代谢组提示代谢健康受损、潜在氧化应激和有益代谢物减少。

微生物组分析：通过第40周颊拭子和粪便样本的16S rRNA基因测序比较。颊拭子含11门、81科、160属；粪便含11门、75科、181属。两组最丰富门为Firmicutes（颊拭子79.1%，粪便65.0%）、Actinobacteria（颊拭子6.7%）和Proteobacteria（粪便23.0%），占全部细菌85%以上。去除口腔微生物后，DRY和CONVL颊拭子常见属分别为Ruminococcaceae_UCG_014（11.0%和9.0%）、Romboutsia（10.1%和4.0%）、Clostridium_sensu_stricto_1（6.7%和3.0%）、Ruminococcaceae_UCG_005（6.1%和9.1%）、Paeniclostridium（5.3%和3.8%）、Lachnospiraceae_NK3A20_group（4.7%和1.3%）、Acetitomaculum（4.5%和1.3%）、Family_XIII_AD3011_group（4.1%和2.3%）和Roseburia（3.6%和1.0%）。粪便常见属在DRY和CONVL中分别为Pseudomonas（9.7%和3.2%）、Romboutsia（8.6%和7.6%）、Ruminococcaceae_UCG_005（7.4%和8.3%）、Paeniclostridium（6.2%和5.2%）、Ruminococcus_2（5.8%和4.0%）、Marinobacter（4.4%和9.4%）、Candidatus_Saccharimonas（3.6%和7.6%）和Clostridium_sensu_stricto_1（3.2%和3.2%）。粪便样本变异大于颊拭子。α多样性方面，CONVL颊拭子Chao1指数更高（P < 0.05），Shannon指数也有显著差异（P < 0.05）；粪便无差异且物种数更低。β多样性用Bray-Curtis评估，颊拭子按日粮分离更明显，粪便重叠更多；热图显示样本按饲喂组聚类。差异丰度分析发现，颊拭子有55个属和7个门显著改变，粪便有46个属和2个门显著改变，每种样本有5个种水平差异分类群。颊拭子中CONVL富集产丁酸菌如Pseudobutyrivibrio、Lachnospiraceae_XPB1014_group、Lachnospiraceae_UCG_009和Lachnoclostridium_1（log₂ fold change > +5，错误发现率（false discovery rate, FDR）< 0.01）；DRY富集Vagococcus或Eremococcus（log₂ fold change < ?4.5，FDR < 0.001）；Euryarchaeota在DRY颊拭子富集（log₂ fold change = ?1.75，FDR < 0.001）。粪便中CONVL富集Akkermansia、Verrucomicrobia、Ruminococcus_torques_group（log₂ fold change > +4，FDR < 0.001）和Bifidobacterium；DRY富集分解糖的Prevotellaceae成员Alloprevotella、Prevotella_9、Prevotella_1和_2（log₂ fold change < ?4，FDR < 0.001），以及Anaeroplasma（log₂ fold change = ?5.4，FDR < 0.001）和Succinivibrio（log₂ fold change = ?3.7，FDR < 0.001）。结论是颊部微生物多样性和组成反映日粮影响；DRY降低有益产丁酸和纤维降解分类群及α多样性，微生物组成反映高精料摄入。

讨论总结：在瘤胃特征方面，DRY公牛瘤胃壁增厚、内容物分层减少、蠕动降低，符合较低peNDF摄入；黏膜增厚被视为奶牛SARA诊断指标。两组瘤胃壁厚度和黏膜与黏膜下层厚度均超过Fiore et al.对年轻育肥Charolais公牛慢性瘤胃酸中毒的阈值（瘤胃壁> 8.2 mm，黏膜和黏膜下层> 5.3 mm）。pH低于5.8至少4 h/天常用作SARA定义，本研究两组均超过但无差异；因pH测量为第5至26周而采样为第28至40周，研究人员将pH作为支持信息而非直接证据。在血浆代谢组方面，DRY马尿酸下调和TMAO上调最明显。马尿酸是苯甲酸甘氨酸结合物，为植物多酚摄入营养标志；低浓度提示前体吸收减少或瘤胃微生物植物酚代谢降低，可能代谢失衡。TMAO由肝脏从三甲胺生成，前体包括甜菜碱和膳食胆碱；人类中升高与代谢炎症和心血管疾病相关，反刍动物证据不明确。DRY含更多大麦、甜菜渣颗粒和甜菜糖蜜，可能胆碱和甜菜碱摄入更高，但未测，不能直接证明。3-IPA是肠道微生物衍生色氨酸代谢物，具抗氧化、抗炎、免疫调节和肠屏障支持特性；DRY降低提示微生物色氨酸代谢改变和保护性吲哚全身可用性降低。PC降低涉及膜脂、能量代谢、脂蛋白转运和细胞信号，与过肥奶牛PC降低一致。CE降低提示脂蛋白代谢紊乱或炎症降解，与产后和过渡期低CE一致。甲硫氨酸亚砜升高是甲硫氨酸氧化产物，氧化应激标志；DRY第28周升高，提示氧化状态和蛋白维持失衡。TG升高第28周5种、第40周20种，含亚油酸、油酸、肉豆蔻酸，与日粮有关，健康解释困难。在颊部与粪便微生物组方面，微生物组仅第40周，代表长期暴露后终点，不能判断时间变化；粪便反映大肠而非瘤胃或全胃肠道，颊拭子非瘤胃直接代理，解释限于基质内模式，作为描述性和假设生成证据。粪便变异更大不应解释为日粮无效应。CONVL颊部多样性更高，可能反映不同饲料和青贮微生物；高精料可降低颊部α多样性。DRY颊拭子富集Vagococcus、Eremococcus、Thermoactinomyces等环境或非瘤胃相关分类群，提示口腔或环境分类群过滤需改进；Euryarchaeota和Methanobrevibacter在DRY颊拭子更高，但与甲烷排放试验无差异，关系待研究。粪便CONVL富集Akkermansia和Ruminococcus_torques_group，有助维持肠黏膜；DRY富集Prevotella、Anaeroplasma和Succinivibrio。在代谢组学与微生物组学潜在关联方面，研究非因果；未发现特定细菌与3-IPA或TMAO一致；TMAO与Methanobrevibacter信号不一致；多组学数据作为收敛的假设生成证据，支持代谢负担。总体而言，微生物组成反映高精料摄入，瘤胃壁增厚超过SARA阈值，提示干日粮和CONVL日粮均对动物健康构成风险；高生长率表明公牛仍可补偿，但胃肠道补偿能力有限。未来需纳入反刍时间、粪便一致性等参数，同步pH采样，并用屠宰发现验证。

研究结论翻译：DRY和CONVL日粮均支持相似生长性能，但饲喂DRY-TMR的公牛表现出代谢和瘤胃健康受损迹象。饲喂DRY的公牛瘤胃壁厚度增加、蠕动降低、瘤胃内容物分层减少。血浆代谢组学显示，饲喂DRY的公牛TMAO和甲硫氨酸亚砜浓度较高，马尿酸和3-IPA较低，表明广泛的日粮相关代谢特征、潜在氧化应激和有益代谢物含量降低。饲喂DRY的公牛颊部微生物多样性较低，反映不同饲料类型。观察到的生物学效应不应解释为对日粮配制生态策略的评价，而应解释为育肥公牛对两种在饲料、颗粒大小和纤维组成上不同的特定TMR的生理反应。研究人员认为，这些变化应被视为鉴于育肥公牛短寿命、为粮食安全可容忍的单纯适应性反应，还是应归类为设计日粮时需考虑的对动物福利和动物健康的相关限制，仍有争议。