缺氧与内质网应激相关基因标签在胶质母细胞瘤预后预测中的应用：一种整合机器学习方法

《Cancer Informatics》：A Hypoxia and ER Stress-Related Gene Signature for Prognostic Prediction in Glioblastoma: An Integrated Machine Learning Approach

　　

背景：胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）是最具侵袭性的原发性脑肿瘤之一，预后极差。缺氧和内质网（endoplasmic reticulum，ER）应激已被证实可促进GBM的发展，但二者在GBM预后中的联合作用尚未明确。 目的：本研究旨在表征GBM中缺氧与ER应激相互作用所产生的分子特征，并评估其预后价值。 方法：利用limma软件包从GSE116520数据集中识别GBM与正常组织间的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。将缺氧相关与ER应激相关的DEGs取交集，获得聚焦基因集。在TCGA-GBM队列中采用LASSO Cox回归构建预后模型。进行加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）以识别关键模块，并进一步通过支持向量机（Support Vector Machine，SVM）和随机森林（Random Forest，RF）算法筛选核心基因。通过转录因子分析、甲基化谱分析、免疫浸润评估及单细胞RNA测序分析对核心基因进行验证。 结果：共鉴定出265个HEDEGs。由SPP1、CYGB、PLAUR和HSPB1组成的四基因预后模型在训练集和内部验证数据集中将患者分为总生存期不同的组别。共识聚类识别出两个具有不同免疫特征和生存结局的分子亚型。整合WGCNA和机器学习分析确定KCNMA1、ANGPT2和XBP1为候选核心基因。ANGPT2和XBP1高表达与较差的总生存期相关，而KCNMA1高表达与较好的生存相关。单细胞分析揭示了这些基因在GBM微环境中的细胞类型特异性表达模式。 结论：本研究开发了一个四基因预后模型，并鉴定了三个与GBM中缺氧和ER应激相关的候选核心基因。这些发现为进一步研究应激相关的分子异质性和预后分层提供了基础，但仍需独立的外部验证和实验确认。

一、研究背景与问题

胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）是最具侵袭性和致死性的原发性脑肿瘤。尽管标准治疗方案包括最大安全手术切除后联合放疗及同步和辅助替莫唑胺化疗，患者中位总生存期仍仅为12至15个月，五年生存率低于7%。这种不良预后主要源于内在性和获得性药物抵抗，其背后是显著的瘤内异质性和免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）。此外，缺乏可靠的生物标志物来辅助预后判断和治疗策略制定，严重制约了GBM的临床管理。因此，亟需构建稳健的预后模型以改善GBM患者的临床决策和治疗结局。

缺氧是GBM的常见特征，源于肿瘤细胞快速增殖超过氧扩散能力、广泛坏死以及结构和功能异常的肿瘤血管系统。缺氧条件下，癌细胞稳定缺氧诱导因子1-α（hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF-1α），驱动血管内皮生长因子介导的血管生成，同时招募免疫抑制细胞进入TME。在营养匮乏条件下，肿瘤细胞高度依赖有氧糖酵解（Warburg效应），产生乳酸和CO?使周围组织酸化。伴随的代谢和氧化应激促进蛋白质错误折叠和聚集，触发适应性未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），通过IRE1α、ATF6和PERK三种ER驻留感受器的协同作用恢复蛋白质稳态。缺氧与ER应激在机制上相互关联：缺氧通过HIF-1α和PERK通路激活UPR，而ER应激可反向增强HIF-1α活性，形成促进肿瘤适应和免疫逃逸的正反馈环路。然而，既往预后模型多依赖单一应激通路，未考虑缺氧与ER应激的协同作用，二者在GBM肿瘤发生中的联合机制仍知之甚少。因此，研究人员旨在系统探讨这两种应激通路在GBM中的协同效应。

二、研究内容与主要技术方法

研究人员从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库获取GSE116520（17例GBM和8例正常样本）和GSE4290（81例GBM和23例正常样本）两个微阵列数据集，从GDC数据门户获取TCGA-GBM队列的基因表达谱及临床数据，并从GEO获取GSE84465单细胞RNA测序数据（来自4例GBM患者）。缺氧和ER应激相关基因从GeneCards数据库检索获得。主要技术方法包括：利用limma软件包进行差异表达分析并鉴定HEDEGs；采用clusterProfiler进行GO和KEGG功能富集分析；在TCGA-GBM队列中运用LASSO Cox回归构建预后模型；采用ConsensusClusterPlus进行共识聚类；运用CIBERSORT等多种算法评估免疫细胞浸润；利用WGCNA识别与GBM表型高度相关的共表达模块；在外部数据集GSE4290中应用随机森林（RF）和支持向量机（SVM）两种机器学习算法进行特征选择；通过转录因子预测、启动子甲基化分析、免疫浸润评估及单细胞RNA测序分析对核心基因进行多维度验证；利用oncoPredict软件包基于CTRP数据库进行药物敏感性预测。

三、研究结果

HEDEGs的鉴定与功能富集分析。 通过差异表达分析，研究人员在GBM与正常组织间鉴定出7122个DEGs，其中上调3505个、下调3617个。将DEGs与GeneCards数据库中859个缺氧相关基因和5603个ER应激相关基因取交集，获得265个HEDEGs。GO分析显示这些基因与细胞-细胞黏附调控、上皮细胞增殖和胶质细胞分化等生物学过程密切相关；KEGG通路分析揭示其显著富集于HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路，提示缺氧与ER应激的交互作用可能通过调控这些关键的促生存和促增殖信号通路驱动GBM恶性进展。

基于HEDEGs的预后签名验证。 在TCGA-GBM队列中，LASSO Cox回归结合10折交叉验证筛选出20个在λmin处具有非零系数的HEDEGs，多变量Cox比例风险回归最终保留SPP1、CYGB、PLAUR和HSPB1四个基因构建预后风险评分。单变量Cox分析显示四个基因高表达均与风险增加显著相关，其中PLAUR的风险比最大。多变量分析中仅HSPB1保持独立预后价值。依据中位风险评分将患者分为高低风险组，训练集中高风险组总生存期显著缩短（HR=3.92，95% CI：2.66–5.79，P<0.001）；内部验证集同样证实了风险评分的预后分层能力（HR=1.44，95% CI：1.02–2.02，P=0.036）。

HEDEG相关分子亚型的鉴定与表征。 基于预后基因表达谱的共识聚类分析确定k=2为最优亚型数（C1和C2）。免疫微环境分析显示，C1亚型中TIM-3、ITPRIPL1、PD-L2和TIGIT等多个抑制性免疫检查点分子表达显著高于C2亚型；C1亚型富集M0和M2巨噬细胞等免疫抑制细胞，而C2亚型富集CD8?T细胞和调节性T细胞（Tregs），表明两种亚型具有独特的转录组和免疫特征。

WGCNA揭示与HEDEGs相关的共表达模块。 在GSE116520数据集中，WGCNA识别出15个与GBM进展相关的模块。选择软阈值功率6构建无尺度网络。模块-性状相关性分析显示黑色模块与GBM状态相关性最强（r=?0.98，P<0.001），且模块成员度与基因显著性呈强正相关（cor=0.86，P<0.001），该模块被确定为关键模块。

外部验证与机器学习特征选择鉴定核心基因。 将黑色模块的1587个基因与265个HEDEGs取交集，获得50个候选基因。基因集变异分析显示这些基因与未折叠蛋白反应、缺氧、TNF-α/NF-κB信号、上皮-间质转化和炎症反应等关键GBM通路显著相关。在外部数据集GSE4290中，RF和SVM两种算法筛选出三个共识核心基因：ANGPT2、KCNMA1和XBP1。ANGPT2和XBP1在GBM中显著上调，KCNMA1则显著下调。

核心基因的预后价值评估。 三个核心基因的表达与分子亚型、肿瘤分级、患者年龄、总生存期、肿瘤复发和化疗状态等关键临床变量相关。ROC分析显示KCNMA1诊断准确性最高（AUC=0.932），其次为XBP1（AUC=0.855）和ANGPT2（AUC=0.839）。整合三个核心基因与临床病理变量的列线图经1000次bootstrap内部验证，表观C指数为0.812，校正后C指数为0.795。Kaplan-Meier分析显示ANGPT2和XBP1高表达与较短总生存期相关，KCNMA1高表达与较长总生存期相关。时间依赖性ROC分析中，ANGPT2在1-3年预测中AUC最高（0.810–0.823），XBP1次之（0.749–0.776）。

核心基因表达与免疫细胞的关系。 免疫网络分析显示ANGPT2和XBP1与免疫抑制细胞类型（尤其是M2巨噬细胞）呈强正相关，而KCNMA1与这些细胞群呈负相关，并与滤泡辅助性T细胞等免疫刺激亚群正相关，表明ANGPT2和XBP1与免疫抑制微环境相关，KCNMA1则与免疫刺激状态相关。

ANGPT2、KCNMA1和XBP1的上游转录与表观遗传调控。 转录因子预测鉴定出ANGPT2的6个共享TFs（如GATA2、FOXA1、MYC）、KCNMA1的3个（如REST、CTCF）和XBP1的4个（如STAT3、FOXA1）。启动子甲基化分析显示ANGPT2在GBM中呈低甲基化，提示其上调可能部分源于表观遗传去抑制；KCNMA1和XBP1甲基化变化较小。生存分析将KCNMA1启动子高甲基化与更好的疾病特异性生存、总生存和无进展生存相关联。

核心基因表达的单细胞验证。 单细胞RNA测序分析显示ANGPT2几乎 exclusively 表达于血管细胞，与其血管生成作用高度一致；KCNMA1主要富集于少突胶质前体细胞和神经元；XBP1主要表达于血管细胞和单核细胞/巨噬细胞，在AC样恶性细胞中也有可观水平，提示其在肿瘤血管UPR调控、免疫细胞活性调节及恶性细胞应激适应中发挥作用。

核心基因的药物敏感性特征。 ANGPT2表达与多种治疗化合物（包括HDAC抑制剂、氧化应激诱导剂和细胞周期靶向药物）的敏感性呈广泛负相关，提示高ANGPT2表达可能促进GBM细胞的多药耐药表型。KCNMA1表达与多种化合物（如CDK抑制剂dinaciclib）的敏感性呈正相关，提示KCNMA1高表达细胞可能对靶向或细胞毒性治疗更敏感。XBP1与大多数药物仅呈弱相关或非显著相关。

四、讨论与结论

讨论部分指出，缺氧与ER应激协同促进免疫抑制性巨噬细胞分化并影响抗原呈递功能，从而抑制T细胞活性，共同导致免疫逃逸和药物抵抗。C1分子亚型表现出更高的M2巨噬细胞浸润、免疫检查点分子高表达和效应T细胞活性降低，这些特征均与较低的治疗效率和生存率相关。三个核心基因通过不同但互补的机制（血管生成、蛋白质稳态和神经-免疫）塑造GBM进展。与既往仅基于单一应激通路的预后模型相比，本研究整合缺氧和ER应激通路、进行内部拆分样本评估并纳入免疫浸润、甲基化和单细胞表达等多层生物学证据，模型AUC达0.812，提示预测性能更优。药物敏感性预测仅基于CTRP体外数据，应视为探索性假设而非临床建议。

研究结论为：研究人员开发并验证了一个基于缺氧和ER应激相关基因的胶质母细胞瘤预后预测基因签名，采用整合机器学习方法。所鉴定的三个核心基因——ANGPT2、XBP1和KCNMA1——与患者生存、免疫浸润、表观遗传调控和药物敏感性相关。风险分层模型为GBM患者的预后评估提供了稳健工具，凸显了缺氧-ER应激交互作用作为治疗靶点的临床潜力。未来需开展前瞻性研究以验证该签名的临床实用性。