2型糖尿病合并睡眠障碍患者肠道菌群与血清代谢物谱的探索性研究：16S rRNA基因测序与非靶向液相色谱-质谱联用代谢组学分析

《Frontiers in Microbiology》：An exploratory study of gut microbiota and serum metabolite profiles in type 2 diabetes patients with sleep disorders

　　

目的：表征伴或不伴睡眠障碍的T₂DM患者肠道菌群组成和血清代谢物。方法：该单中心横断面研究入组40例伴睡眠障碍的T₂DM患者（组I）、40例不伴睡眠障碍的T₂DM患者（组N）和30名年龄、性别匹配的健康对照（组ZC）。分别采集粪便和血清样本进行16S rRNA基因测序和非靶向液相色谱-质谱联用（LC-MS）代谢组学分析。分析肠道菌群组成、血清代谢物和代谢通路，以及微生物-代谢物相关性。结果：与不伴睡眠障碍的T₂DM患者相比，伴睡眠障碍的T₂DM患者肠道微生物多样性和均匀度降低，表现为较低的Shannon、Simpson和Pielou均匀度指数。Beta多样性分析显示，组I和组N之间微生物结构存在小但统计学显著的差异。在属水平，两组间观察到名义上的差异，包括组I中TM7x、Achromobacter和Pseudomonas相对丰度较高，Eubacterium_eligens_group、Lachnospiraceae_UCG-001和Negativibacillus相对丰度较低。代谢组学结果揭示组I和组N之间有17种名义差异代谢物，涉及咖啡因代谢以及卟啉和叶绿素代谢。Spearman分析显示，粪胆素丰度与Lachnospiraceae_UCG-001（R = 0.381，P < 0.001，Q = 0.095）、Lachnospiraceae_ND3007（R = 0.354，P = 0.002，Q = 0.121）和Odoribacter（R = 0.280，P = 0.01，Q = 0.301）呈正相关。结论：伴睡眠障碍的T₂DM患者肠道微生物群落结构存在适度差异，血清代谢物谱存在探索性变化。粪胆素和咖啡因相关代谢特征可能代表T₂DM中与睡眠障碍相关的探索性特征。这些发现提示潜在的微生物群-代谢物关联，并为未来纵向和机制研究提供基础。

研究背景：T₂DM（type 2 diabetes mellitus，2型糖尿病）是以长期血糖升高为特征的代谢紊乱，临床可见多饮、多尿、多食和体重减轻，并可出现急慢性严重代谢紊乱、感染、微血管并发症等。过去40年，T₂DM已成为全球严重公共卫生问题之一，中国患病率显著增至10.4%。睡眠障碍包括失眠、嗜睡、睡眠呼吸暂停综合征和不宁腿综合征。越来越多证据提示T₂DM与睡眠障碍相关：糖尿病相关代谢紊乱使糖尿病患者睡眠障碍患病率显著高于健康人群，最高可达52%；睡眠障碍者发生糖尿病风险增加40%；队列研究提示短睡眠时长是T₂DM危险因素。但T₂DM合并睡眠障碍的病理机制尚不清楚。研究人员提出假说，T₂DM与睡眠障碍之间存在双向病理生理互作，肠道菌群及其代谢物可能在该互作中起关键作用。肠道菌群通过短链脂肪酸（SCFAs, short-chain fatty acids）、脂多糖（LPS, lipopolysaccharides）、氨基酸（AAs, amino acids）和胆汁酸等代谢产物调节机体代谢和免疫稳态，并与T₂DM发生发展及睡眠调节相关；补充益生菌可降低睡眠质量指数评分并改善睡眠质量。但肠道菌群在T₂DM合并睡眠障碍者中的作用仍待探索。代谢组学可定量分析小分子代谢物，识别差异代谢物及代谢通路，从而在整体代谢水平揭示相关机制。因此，研究人员采用16S rRNA基因测序和代谢组学分析，比较伴与不伴睡眠障碍的糖尿病患者肠道菌群和血清代谢物差异。

关键方法概述：本研究为单中心横断面设计，样本队列来自2023年1月至6月盐城市第三人民医院随机入组的80例T₂DM患者，以及同期同一社区30名无睡眠障碍健康志愿者。T₂DM患者按有无睡眠障碍分为组I（n = 40）和组N（n = 40），健康对照为组ZC（n = 30）。主要关键技术包括粪便16S rRNA基因V3–V4区测序、血清非靶向液相色谱-质谱联用（LC-MS, liquid chromatography–mass spectrometry）代谢组学、操作分类单元（OTUs, operational taxonomic units）聚类与注释、α/β多样性分析、LEfSe（linear discriminant analysis effect size，线性判别分析效应量）、非度量多维尺度分析（NMDS, non-metric multidimensional scaling）、PERMANOVA（permutational multivariate analysis of variance，置换多元方差分析）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA, partial least squares discriminant analysis）、KEGG通路富集、Spearman相关、Benjamini–Hochberg错误发现率（FDR, false discovery rate）校正及MaAsLin2协变量模型。

研究结果：
3.1 研究参与者特征：共纳入110例受试者。三组在性别、年龄、身高和体重方面无统计学显著差异；组I和组N降糖药物使用无显著差异；三组腰围有显著差异，两个糖尿病组腰围显著高于组ZC，但组I与组N无显著差异；组I与组N糖尿病病程无显著差异。组I、组N和组ZC的PSQI（Pittsburgh Sleep Quality Index，匹兹堡睡眠质量指数）评分分别为18.53 ± 1.77、2.53 ± 1.95和2.80 ± 1.63。所有参与者按要求采集样本并完成试验，无脱落。
3.2 各组血糖和血脂水平比较：FPG、1hPBG、2hPBG和HDL-C水平在三组间有显著差异。组I和组N的FPG、1hPBG、2hPBG显著高于组ZC；组N的HDL-C低于组ZC；其余血脂和血糖指标组间无显著差异；组I与组N之间血糖和血脂水平无显著差异。
3.3 肠道菌群多样性和丰富度分析：Shannon-Wiener曲线趋于平坦，Good's coverage指数均超过0.9998。α多样性分析显示，组I的Shannon和Simpson指数低于组N（P = 0.01和P = 0.03），Pielou均匀度指数低于组N（P < 0.01），Dominance指数高于组N（P = 0.01）。β多样性分析中NMDS应力值为0.15，组I与组N微生物群落大量重叠；基于Weighted UniFrac的PERMANOVA显示两组整体微生物群落结构存在小但统计学显著差异（R² = 0.0306，P = 0.041）；组I与组ZC（R² = 0.1112，P = 0.001）、组N与组ZC（R² = 0.0457，P = 0.009）也存在显著差异。
3.4 各组差异菌群分析：LEfSe分析显示各组具有优势菌群，共有17个细菌分类群丰度差异显著。组I中Selenomonadaceae、Pseudomonadaceae、Pseudomonas、Megamonas、Pseudomonadales、Gammaproteobacteria和Proteobacteria丰度高于组N和组ZC；组N中Veillonellaceae、Escherichia_Shigella和Veillonellales_Selenomonadales较丰富；组ZC中Bacteroidota、Bacteroidaceae、Prevotellaceae、Prevotella、Bacteroidales、Bacteroides和Bacteroidia丰度较高。属水平上，组I中TM7x、Achromobacter和Pseudomonas高于组N，组N中Bacteroides、Odoribacter、Eubacterium_eligens_group、Lachnospiraceae_ND3007、Lachnospiraceae_UCG-001和Negativibacillus高于组I。但经Benjamini–Hochberg校正后，9个属均不显著（q = 0.71）；MaAsLin2协变量模型校正后也无属达到统计学显著，仅TM7x和Eubacterium_eligens_group在名义水平保持同向关联。因此，属水平差异应视为探索性信号。
3.5 代谢物分析和差异通路鉴定：QC样本Pearson相关R²接近1，提示数据可靠。PLS-DA显示组I与组ZC、组N与组ZC间差异明显，组I与组N虽有重叠但仍存在分离趋势。
3.5.1 睡眠障碍对糖尿病患者代谢物的影响（组I vs 组N）：PCA显示组I和组N部分重叠但有分离倾向。以VIP ≥ 1、FC > 1.5、P < 0.05为标准，鉴定出17种差异代谢物，其中14种为MSI Level 2，3种为MSI Level 3；另有2种因化学合理性不足被视为推定注释并排除。与组N相比，组I有11种代谢物上调、6种下调。经Benjamini–Hochberg校正后均不显著（最小q = 0.197）。粪胆素下降（FC = 0.28，P = 0.02，q = 0.813），可可碱下降（FC = 0.52，P = 0.04，q = 0.813）。差异代谢物富集于卟啉和叶绿素代谢及咖啡因代谢，但通路富集未达统计学显著（P = 0.12和P = 0.14）。
3.5.2 磷酸戊糖途径被鉴定为组I与组ZC间的差异代谢通路：组I与组ZC明显分离，PLS-DA模型R²Y = 0.90、Q² = 0.74。鉴定出114种差异代谢物，MetaboAnalyst 5.0分析得到22条代谢通路，其中磷酸戊糖途径为候选通路（P < 0.05），涉及葡萄糖酸内酯和D-葡萄糖酸。该比较反映糖尿病相关改变，而非睡眠障碍特异性效应。
3.5.3 组N与组ZC间胆汁酸和胆固醇代谢通路的差异代谢组学分析：PLS-DA模型R²Y = 0.90、Q² = 0.74，无过拟合。鉴定出106种差异代谢物，KEGG通路富集分析得到22条显著富集通路，前三位为初级胆汁酸生物合成（P = 0.0025）、胆汁分泌（P = 0.0025）和胆固醇代谢（P = 0.0424）。这些结果主要作为糖尿病相关代谢改变背景。
3.6 微生物-代谢物关联：在9个差异肠道菌群和17个差异血清代谢物之间检测到10个未校正P < 0.05的相关，其中7对正相关、3对负相关。粪胆素与Lachnospiraceae_UCG-001（R = 0.381，P < 0.001，Q = 0.095）、Lachnospiraceae_ND3007（R = 0.354，P = 0.002，Q = 0.121）和Odoribacter（R = 0.280，P = 0.01，Q = 0.301）正相关。

讨论部分总结：睡眠障碍是T₂DM常见共病，日益被认为是影响代谢健康和生活质量的重要因素。研究人员发现，伴睡眠障碍的T₂DM患者肠道菌群多样性和均匀度降低，菌群分类组成发生变异，并鉴定出若干差异菌群；代谢组学发现17种差异代谢物，富集于卟啉和叶绿素代谢及咖啡因代谢。两个糖尿病组无论有无睡眠障碍，均显示Bacteroidota、Bacteroidaceae、Prevotellaceae、Prevotella、Bacteroidales、Bacteroides和Bacteroidia丰度显著降低；Bacteroides和Prevotella为参与碳水化合物代谢和短链脂肪酸产生的厌氧菌，其减少提示糖尿病人群特征性菌群失调。脑-肠轴通过神经、内分泌、免疫和代谢途径介导双向通讯，肠道菌群及其代谢物参与睡眠调节和神经功能。本研究中，组I的TM7x、Achromobacter和Pseudomonas较高，Eubacterium_eligens_group、Lachnospiraceae_UCG-001和Negativibacillus较低；Achromobacter和Pseudomonas与免疫失调和机会感染有关，Eubacterium_eligens_group和Lachnospiraceae_UCG-001通常被视为有益微生物，参与胆汁酸代谢、肠道屏障维持和宿主代谢稳态，Lachnospiraceae_UCG-001还与睡眠质量相关。粪胆素是血红素代谢下游产物，与卟啉代谢密切相关，可能反映宿主代谢活动和肠道微生物代谢；肠道微生物参与血红素转化为胆绿素、胆红素、尿胆素原并最终形成粪胆素，胆色素家族具有内源性抗氧化特性并参与代谢稳态。本研究中伴睡眠障碍的糖尿病患者血清粪胆素较低，且粪胆素与Odoribacter、Lachnospiraceae_ND3007和Lachnospiraceae_UCG-001正相关。咖啡因代谢为另一候选通路，可可碱是咖啡因主要代谢物，对中枢神经刺激较弱；本研究中伴睡眠障碍患者血清可可碱降低。但循环可可碱也受近期咖啡、茶等含咖啡因产品摄入影响，且未记录来源、剂量和时间，不能区分摄入差异或代谢改变，因此咖啡因通路关联仍为探索性。局限性包括：饮食尤其是咖啡因摄入和睡眠相关药物未严格控制，晨间采样时间未标准化；缺乏客观睡眠监测和昼夜节律评估，仅依据主观评分分组，不能区分睡眠障碍亚型；每组40例对主要结局中等至大效应有80%把握度，但不足以检测细微差异和高维组学分析；Benjamini–Hochberg校正后多数组学差异未达统计学显著；单中心设计限制普遍性。未来需多中心、大样本和更全面分析框架验证。

研究结论翻译：伴睡眠障碍的T₂DM患者显示肠道微生物群落结构的适度差异和血清代谢物谱的探索性变化。粪胆素和咖啡因相关代谢特征可能代表T₂DM中与睡眠障碍相关的探索性特征。这些发现提示潜在的微生物群-代谢物关联，并为未来纵向和机制研究提供基础。