《Frontiers in Oncology》：Multi-cohort screening of PANoptosis-related genes reveals PARP1 as a key target, and AZD5305 exerts anti-tumor effects in neuroblastoma
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背景： 神经母细胞瘤（NB）是婴幼儿最常见的颅外恶性实体肿瘤。约半数高危NB患儿对一线治疗存在原发性耐药或治疗后两年内出现疾病复发，导致总生存率极低。PANoptosis是一种整合了焦亡（pyroptosis）、凋亡（apoptosis）和坏死性凋亡（necr
背景： 神经母细胞瘤（NB）是婴幼儿最常见的颅外恶性实体肿瘤。约半数高危NB患儿对一线治疗存在原发性耐药或治疗后两年内出现疾病复发，导致总生存率极低。PANoptosis是一种整合了焦亡（pyroptosis）、凋亡（apoptosis）和坏死性凋亡（necroptosis）的炎症性程序性细胞死亡模式；然而，PANoptosis相关基因（PANoptosis-related genes, PRGs）在NB中的功能相关性尚不明确。本研究旨在探索与NB预后相关的PRGs及其与肿瘤免疫微环境的关联，从而为NB识别新的治疗靶点。
方法： 利用来自三个公共NB数据集（GSE49711-NB、TARGET-NB和E-MTAB-8248-NB）的mRNA表达谱，研究19个既往已报道PRGs的预后作用。在每个队列中分别进行独立Cox回归筛选以识别队列特异性预后相关PRGs，随后通过Venn交集分析确定保守的预后基因。在127例临床NB患者的肿瘤组织中验证了PARP1的表达。将基于PARP1表达的GIS评分与临床元数据相结合，评估其预后价值。通过体外（in vitro）功能实验探讨PARP1抑制剂AZD5305的抗肿瘤作用及机制。
结果： Venn交集分析确定PARP1是唯一在异质性NB患者群体中具有一致性预后意义的共享基因。体外实验显示，AZD5305显著抑制NB细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，并将细胞周期阻滞在G0/G1期。
结论： 本研究采用多队列平行筛选策略挖掘NB的保守治疗靶点。研究数据表明，通过AZD5305抑制PARP1代表了一种有前景的NB治疗策略。
论文解读
一、研究背景与科学问题
神经母细胞瘤（Neuroblastoma, NB）是婴幼儿和儿童期最常见的颅外恶性实体肿瘤，来源于原始交感神经前体细胞。全球范围内NB约占儿童恶性肿瘤总数的6%~10%，在我国儿童恶性实体瘤中发病率居首位。NB临床表现多样，常呈侵袭性生长且边界不清，手术难以完全切除。目前NB主要采用手术、放疗和化疗相结合的综合治疗模式，但约半数高危患儿对一线治疗不敏感或在治疗后两年内复发，晚期及转移性患儿长期生存率不足40%。因此，寻找NB特异性的治疗靶点、提高尤其高危患儿的生存率，仍是亟待解决的临床难题。
细胞死亡是机体发育、稳态维持和免疫应答的核心环节。焦亡、凋亡和坏死性凋亡是遗传学上最明确的程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD）通路。近年研究发现，多种细胞死亡现象在肿瘤中并存，PCD亚通路（包括凋亡、焦亡、坏死性凋亡等）在肿瘤发生发展中发挥关键作用，单一或联合PCD亚通路调控失控可能导致肿瘤发生。此前研究多强调各通路单独调控的独特性，但新兴证据揭示了这些看似独立的细胞死亡复合物之间的共调控与相互作用，由此提出PANoptosis的概念——一种由PANoptosome复合物调控的炎症性程序性细胞死亡模式，兼具焦亡、凋亡和坏死性凋亡的关键特征。
PANoptosis相关基因（PANoptosis-related genes, PRGs）已在多种肿瘤类型中观察到异常表达，如NLRP3、caspase-8和TNFAIP3等，且检测到显著突变。许多PRGs已被证实为不同肿瘤类型的风险因素。例如，Zhang等发现CD8A和CXCL6在肝细胞癌组织和细胞系中高表达；Wang等发现PRGs与皮肤黑色素瘤进展密切相关，可用于风险评估和免疫景观重建；Wang等发现LGR5和VSIG4在结肠癌中差异表达，表明基于PANoptosis的分子分型具有预测预后和肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）的潜力。已有研究报道PRGs和PANoptosis评分分别与21种和14种肿瘤类型患者的生存显著相关。这些发现提示PANoptosis可能对某些肿瘤具有抑制作用，诱导PANoptosis可能有助于抑制肿瘤的发生和发展，而癌症进展可能与癌细胞逃避PANoptosis的机制有关。
在NB中，已有研究报道了焦亡、凋亡和坏死性凋亡的存在。Zhao等发现抑制焦亡可降低NB对顺铂的敏感性；Li等发现高焦亡水平NB具有较好的总生存率和更多的抗肿瘤免疫细胞浸润；Luo等整合四个NB数据集构建了焦亡评分，发现高评分与NB患者良好预后、免疫激活和免疫检查点阻断治疗反应增加相关。凋亡失败被认为促进肿瘤发生，且凋亡逃逸可能导致治疗耐药，因为化疗、放疗和免疫治疗等临床抗癌手段的细胞毒活性主要依赖触发肿瘤细胞凋亡。B J Maurer等研究表明，合成维A酸类化合物可通过诱导NB细胞坏死性凋亡而成为NB治疗的潜在策略。然而，目前尚无基于生物信息学方法在NB中识别PANoptosis相关机制的研究。
本研究旨在通过三个独立患者队列的平行预后分析，筛选NB中稳定的PANoptosis相关治疗靶点，而非建立并验证一个通用预测基因标签，以期为NB提供潜在的治疗靶点。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员从公共数据库获取三个独立NB队列（GSE49711、TARGET-NB、E-MTAB-8248，数据获取日期为2023年7月27日）进行平行预后基因筛选，排除随访记录不完整者后共纳入968例患者进行生存分析。收集的临床协变量包括年龄、性别、COG风险分层、MYCN扩增状态、INSS分期及总生存状态。该多队列平行分析框架旨在识别在不同异质性患者群体中具有一致预后性能的PRGs，而非训练并外部验证单一统一预测基因标签。研究共纳入19个既往文献报道的PRGs。在GSE49711队列中，利用ConsensusClusterPlus进行无监督共识聚类分析，采用pam聚类算法和1-皮尔逊相关距离，重采样80%样本重复10次，将患者分为两个PANoptosis分子亚型。利用GSVA富集分析和IOBR评估TME相关免疫细胞浸润。在GSE49711队列中，采用LASSO回归结合10倍交叉验证筛选候选基因，随后通过多因素Cox回归筛选独立预后PRGs，构建11基因预后特征并计算RiskScore，利用maxstat算法确定最优截断值（43.472）进行风险分层。在TARGET-NB和E-MTAB-8248队列中分别重复独立Cox回归筛选和maxstat分层流程。三个队列的预后相关PRGs取交集筛选关键基因。利用免疫组织化学染色（IHC）和德国化学评分（German Immunoreactive Score, GIS）验证127例临床NB患儿肿瘤组织中PARP1表达水平。体外实验采用CCK-8、Edu、划痕实验、Transwell、Annexin V凋亡检测和PI/RNase细胞周期分析评估AZD5305对SK-N-SH和SK-N-DZ细胞系的影响。体内实验采用BALB/c小鼠皮下注射Neuro-2a细胞建立移植瘤模型，评估AZD5305单药及与顺铂联合的抗肿瘤疗效和安全性。
三、研究结果
基于PANoptosis相关基因的分子亚型： 在GSE49711队列中，基于19个PRGs的共识聚类分析将患者分为两个PANoptosis相关分子亚型，两亚型间总生存率、基质/免疫评分及免疫细胞浸润丰度存在显著差异。由于该聚类仅为探索性单队列分析，未进行跨队列验证，因此未基于此聚类系统进行后续预后和免疫学验证。
三个独立NB队列的预后相关PRGs筛选： 通过独立队列Cox筛选，分别从GSE49711、TARGET-NB和E-MTAB-8248队列中鉴定出11个、5个和6个预后相关PRGs。在GSE49711队列中，LASSO-Cox分析构建了16基因模型，经多因素Cox筛选出11个预后相关PRGs（包括PARP1、FADD、TRADD、CASP8、MLKL、AIM2、TAB3、TNFAIP3、IRF1、PSTPIP2和CASP7），风险分层后高、低风险组间生存差异显著，时间依赖ROC曲线显示1年、3年和5年AUC分别为0.86、0.88和0.89。TARGET-NB队列筛选出PARP1、TAB2、MLKL、ZBP1和RIPK3共5个预后PRGs，AUC分别为0.73、0.68和0.68。E-MTAB-8248队列筛选出PARP1、RIPK1、GSDMD3、CASP7、FADD和NLRP3共6个预后PRGs，AUC分别为0.79、0.83和0.85。
PARP1预后价值的临床验证： 三个队列预后基因列表的交集分析确定PARP1为唯一在异质性NB患者群体中具有稳定预后意义的基因。基于GSE49711临床元数据的相关性分析显示，PARP1表达在死亡患者中显著高于存活者，且与COG高风险分层和MYCN扩增状态密切相关。对127例临床NB患儿肿瘤组织进行免疫组化染色和GIS评分，结果显示PARP1表达在不同INSS分期、MYCN扩增状态和COG风险组间存在显著差异。多因素Cox回归分析显示MYCN扩增状态和GIS评分是影响NB患儿总生存期的独立预后因素，PARP1高表达组预后较差。基于PARP1表达和临床信息构建的列线图预测模型C指数为0.743，1年、3年和5年AUC分别为0.701、0.703和0.627，DCA显示该模型较传统COG风险分层获得更多净获益。
AZD5305体内抑瘤效果与安全性评价： 动物实验显示，2 mg/kg AZD5305显著抑制NB移植瘤生长，而1 mg/kg剂量无明显抑瘤作用。AZD5305单药未引起明显肝肾损伤，而顺铂组出现CREA、BUN、ALT、AST升高及肝肾组织学损伤和肾纤维化。AZD5305与低剂量顺铂（2.5 mg/kg）联用不仅显著增强抑瘤效果，还减轻了顺铂诱导的体重下降和肝肾损伤，减少了肾组织胶原沉积。
AZD5305的细胞毒性作用： CCK-8实验显示AZD5305对SK-N-SH和SK-N-DZ细胞的IC50分别为84 μM和114 μM，且呈剂量依赖性抑制细胞增殖。Edu染色进一步证实AZD5305显著降低NB细胞增殖能力。
AZD5305抑制细胞迁移与侵袭： 划痕实验显示AZD5305处理组SK-N-SH和SK-N-DZ细胞在24小时和48小时的迁移率显著降低。Transwell实验证实AZD5305处理后穿膜细胞数量显著减少，表明其有效抑制NB细胞侵袭能力。
AZD5305诱导凋亡和G0/G1期阻滞： Annexin-V凋亡实验显示AZD5305处理显著增加NB细胞凋亡水平，其中SK-N-SH细胞对凋亡更为敏感。流式细胞术分析显示两种NB细胞系经AZD5305处理后G0/G1期细胞比例显著增加，细胞周期阻滞于G0/G1期。
四、讨论与结论
本研究采用三队列平行独立筛选策略而非传统单队列构建固定标签并在外部验证的方法，系统分析了三个独立NB数据集中的PRGs，筛选出共享预后基因PARP1，并通过体外和体内实验验证了PARP1选择性抑制剂AZD5305的抗肿瘤活性。PARP1作为PARP家族中最核心的成员，承担了细胞内PARP家族90%以上的功能，是DNA损伤修复的关键因子。PARP1在三个NB队列中的风险比（HR）分别为4.36（95%CI: 2.50-7.60）、1.92（95%CI: 1.27-2.90）和5.88（95%CI: 2.88-12.35），均提示PARP1高表达与NB患者不良预后显著相关。PARP抑制剂通过合成致死效应发挥抗肿瘤作用，已在卵巢癌、乳腺癌、输卵管癌、胰腺癌和前列腺癌等肿瘤中取得临床突破。AZD5305作为选择性PARP1抑制剂，在BRCA1/2相关癌症模型中表现出优于第一代PARP抑制剂的抗肿瘤活性，且与铂类药物联用可抑制肿瘤转移并延长小鼠生存。本研究发现AZD5305可抑制NB细胞增殖、迁移和侵袭，诱导凋亡和G0/G1期阻滞，单药使用不引起显著器官损伤，与低剂量顺铂联用可在疗效与安全性之间取得理想平衡，为高危NB患儿化疗困境提供了可行方案。
本研究尚存在一些局限：数据来源于公共数据库且均为回顾性研究，缺乏前瞻性随机样本；不同NB队列存在内在异质性，包括测序平台、样本量和临床特征分布的差异；现有数据尚不能证实PARP1是否直接调控NB中完整的PANoptosis信号级联；AZD5305下游具体信号事件尚未完全阐明，包括γ-H2AX、p-RPA2、PAR化产物、p-ATR、p-CHK1、RAD51和p21等核心DNA损伤应答分子未在本研究中检测。尽管如此，本研究仍是首个在儿童NB中进行PANoptosis相关分析的研究，通过三个公共数据库交叉验证筛选出关键基因，并结合临床样本和临床信息进行了验证。综合生物信息学和实验验证表明，PANoptosis与NB患儿生存结局相关，关键PRGs可作为诊断和治疗的潜在标志物。体外和体内实验初步证明AZD5305通过促进凋亡和诱导细胞周期阻滞抑制NB生长，且与顺铂联用可减轻顺铂诱导的体重下降和肝肾功能损伤。该研究开创了AZD5305在NB治疗中的应用，为耐药性NB患儿提供了有前景的新型靶向治疗策略。
