《Frontiers in Immunology》：Integrative single-cell and bulk transcriptomic analysis identifies monocyte/macrophage senescence-associated candidate genes in pulmonary arterial hypertension
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背景： 肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一种进行性血管疾病，以免疫失调和血管重构为特征。细胞衰老可调节免疫应答，但其在PAH中的作用，尤其是在单核/巨噬细胞（monocytes/macropha
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背景： 肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一种进行性血管疾病，以免疫失调和血管重构为特征。细胞衰老可调节免疫应答，但其在PAH中的作用，尤其是在单核/巨噬细胞（monocytes/macrophages，Mono.Macs）中的作用仍不清楚。本研究整合了单细胞和批量转录组数据，以鉴定与PAH中单核/巨噬细胞相关的衰老相关候选基因。
方法： 研究人员分析了公开可用的PAH和对照肺动脉血管组织的单细胞RNA测序（single-cell RNA-seq）数据。基于MSigDB基因集计算每个细胞的衰老相关评分。通过相关性分析和差异表达筛选鉴定单核/巨噬细胞中的衰老相关基因，并在批量转录组数据集中进一步验证。批量转录组发现阶段使用GSE113439、GSE117261和GSE254617数据集。样本标题审计发现GSE117261与GSE254617之间共享68个PHBI标识符；因此，合并数据代表来自189个独特受试者的257个表达谱。LASSO、随机森林（Random Forest）和XGBoost作为互补的特征选择方法，三种算法共同保留的基因被定义为候选基因，并在独立队列中进行评估。
结果： 单细胞RNA-seq在PAH肺动脉血管组织中鉴定出14种细胞类型，其中树突状细胞（dendritic cells，DC）、T细胞和单核/巨噬细胞的衰老相关评分最高。整合筛选鉴定出405个富集于单核/巨噬细胞的衰老相关基因。多算法筛选优先确定了10个候选基因用于后续评估。经队列内多重检验校正后，外部队列分析在肺组织队列中重现了RGS1、PHLDA1、MAFB和RNF13的发现阶段表达方向，并在PBMC队列中重现了MAFB的表达方向。在名义P值下，RGS1在GSE48149和GSE53408（均为肺组织）中显著上调，PHLDA1在GSE48149（肺组织）中上调。MAFB在GSE33463（PBMC）和GSE48149（肺组织）中显著下调，而RNF13在GSE15197和GSE48149（均为肺组织）中下调。功能分析显示候选基因在免疫炎症和吞噬相关通路中显著富集。基于候选基因的一致性聚类将PAH患者分为两个具有不同表达和通路活性谱的探索性转录组分组。在MCT诱导的PAH大鼠模型中的体内评估显示，7个基因具有显著的方向一致变化，2个基因具有方向一致的非显著趋势，1个基因（PDE4B）方向不一致，支持组织水平表达一致性。
结论： 这些分析确定了PAH中与单核/巨噬细胞相关的衰老相关候选基因集。独立表达分析为RGS1、PHLDA1、MAFB和RNF13作为后续机制和功能验证的候选基因提供了额外支持。
论文解读
一、研究背景与科学问题
肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一种进行性肺血管疾病，以肺血管阻力持续升高为特征，最终导致右心衰竭和过早死亡。肺血管重构伴随慢性炎症和免疫失调是PAH的关键病理特征。尽管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞等多种血管细胞类型参与疾病进展，越来越多的证据表明免疫细胞在塑造肺血管微环境中发挥关键作用。然而，免疫细胞中衰老相关变化如何与PAH进展相关联仍不清楚。
细胞衰老以稳定的细胞周期停滞、代谢改变和分泌促炎介质（统称为衰老相关分泌表型，senescence-associated secretory phenotype，SASP）为特征。近年研究已提示细胞衰老参与PAH的肺血管重构和炎症微环境改变。单核/巨噬细胞在肺血管周围聚集，促进趋化因子产生、细胞外基质重构和促重构信号传导。具有衰老特征的单核/巨噬细胞与代谢重编程、吞噬功能受损和持续促炎信号相关，可能加剧免疫失调和组织重构。然而，PAH中具有衰老特征的单核/巨噬细胞的分子特征仍不清楚。
单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）能够以单细胞分辨率解析复杂疾病中的细胞异质性和细胞类型特异性转录程序。尽管已有PAH相关单细胞研究鉴定出多种免疫和血管细胞亚群及与肺血管重构相关的转录程序，但针对单核/巨噬细胞衰老相关改变的系统分析和候选基因优先排序仍然有限。因此，研究人员开展本研究，旨在整合scRNA-seq和批量转录组数据，系统表征PAH肺血管组织中跨细胞类型的衰老相关转录异质性，并优先确定单核/巨噬细胞相关的衰老候选基因。
二、主要技术方法
研究人员利用公共单细胞数据集GSE210248（来自3例健康供体和3例PAH患者的肺动脉/血管周围组织），经质量控制后保留22,704个细胞，使用Seurat进行标准化和主成分分析（principal component analysis，PCA），采用Harmony校正批次效应，并通过Louvain算法鉴定细胞聚类。基于MSigDB中321个衰老相关基因，使用AddModuleScore计算每个细胞的衰老相关评分，并以UCell排序法验证评分稳健性。通过CytoTRACE评估细胞干性，CellChat分析细胞间通讯。在批量转录组层面，整合GSE113439、GSE117261和GSE254617三个数据集（经样本标题审计确认GSE117261与GSE254617间存在68个共享PHBI标识符，合并后代表189个独特受试者的257个表达谱），经ComBat批次校正后使用limma鉴定差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。采用LASSO回归、随机森林（Random Forest）和XGBoost三种机器学习算法进行候选基因优先排序，三算法交集定义为优先候选基因。在独立队列（GSE15197、GSE48149、GSE53408肺组织队列；GSE33463、GSE22356、GSE131793、GSE38267 PBMC/全血队列）中验证候选基因表达方向。此外，在MCT诱导的PAH大鼠模型中进行体内验证，通过RT-qPCR检测候选基因表达。
三、研究结果
3.1 单细胞图谱揭示PAH细胞异质性和衰老相关特征
研究人员在PAH肺血管组织中鉴定出14种细胞类型，包括B细胞、树突状细胞（dendritic cells，DC）、内皮细胞（Endo.1、Endo.2）、上皮细胞、成纤维细胞（Fibro）、粒细胞、单核/巨噬细胞（Mono.Macs）、自然杀伤细胞（NK.cells）、平滑肌细胞（SMC.1、SMC.2）、T细胞和T.NK细胞。细胞周期分析显示T细胞、NK细胞和T.NK细胞具有较高S和G2M期评分，而结构细胞主要处于G1期。衰老相关评分分析显示DC、T细胞和Mono.Macs评分最高。MiloR差异丰度分析和比值比（odds ratio，OR）分析表明T细胞、Mono.Macs和DC在高衰老评分组中更富集，而上皮细胞、B细胞和SMC.1在低评分组中更富集。
3.2 衰老相关转录特征与干性、通路活性和细胞通讯相关
CytoTRACE分析显示上皮细胞、SMC.1和SMC.2干性评分最高，而T细胞、T.NK细胞和NK细胞最低。高衰老评分组细胞干性评分低于低评分组。通路活性分析显示高衰老评分组中过氧化物酶体、KRAS信号上调、缺氧通路评分较高，而有丝分裂纺锤体、凋亡和雌激素反应晚期通路评分较低。CellChat分析显示高衰老评分组具有更高的推断相互作用数量和强度，MHC-II、COLLAGEN和LAMININ通路差异最为显著。
3.3 整合分析鉴定单核/巨噬细胞相关衰老候选基因
通过相关性过滤（1,853个基因）和差异表达过滤（1,132个基因）的交集获得405个候选基因。批量转录组分析鉴定出1,469个DEGs，其中34个与单核/巨噬细胞相关候选基因重叠。三种机器学习算法的交集确定了10个优先候选基因：ARRB2、GRINA、MAFB、OLR1、PDE4B、PHLDA1、PLEKHO2、PREX1、RGS1和RNF13。ROC曲线分析显示RGS1具有最高AUC（0.818）。在189个独特受试者的敏感性分析中，所有10个基因均保留发现阶段表达方向并保持显著。外部独立队列验证中，RGS1在GSE48149和GSE53408中显著上调，PHLDA1在GSE48149中上调，MAFB在GSE33463和GSE48149中下调，RNF13在GSE15197和GSE48149中下调。
3.4 候选基因与炎症、免疫浸润和代谢相关
单细胞水平显示候选基因在Mono.Macs、粒细胞和DC中高表达。ssGSEA分析显示PAH患者Mono.Macs浸润评分较低。相关性分析显示RNF13、GRINA、PLEKHO2、ARRB2、MAFB和OLR1与Mono.Macs浸润显著正相关，而PHLDA1显著负相关。GSEA-KEGG富集分析显示ARRB2和MAFB富集于吞噬体、Fc gamma R介导的吞噬和NF-κB信号通路，RNF13富集于细胞周期、同源重组和细胞衰老通路。代谢通路相关性分析显示多个候选基因与卟啉代谢、果糖和甘露糖代谢等通路显著相关。
3.5 候选基因将PAH分为两个探索性转录组分组
基于10个候选基因的一致性聚类将PAH患者分为Group A和Group B两组。Group B中RGS1、PHLDA1、OLR1、MAFB、PREX1和GRINA表达显著较高。通路活性分析显示Group B显著富集Fc gamma R介导的吞噬、Toll样受体信号和JAK-STAT信号等免疫相关通路。
3.6 MCT诱导PAH大鼠模型中的全肺候选基因表达验证
在MCT诱导的PAH大鼠模型中，RVSP和RVHI显著升高，确认PAH模型建立成功。RT-qPCR检测显示7个基因具有显著的方向一致变化，2个基因具有方向一致的非显著趋势，1个基因（PDE4B）方向不一致，支持候选基因在组织水平的表达一致性。
四、讨论与结论
本研究通过整合单细胞和批量转录组数据，系统鉴定了PAH中单核/巨噬细胞相关的衰老相关候选基因。研究结果支持RGS1、PHLDA1、MAFB和RNF13作为后续机制和功能验证的候选基因。这些基因在独立队列和大鼠模型中的表达一致性为其在PAH发病机制中的潜在作用提供了证据。研究也存在局限性，包括单细胞分析中供体数量有限、差异丰度分析缺乏供体水平推断能力、CellChat推断结果具有探索性、共识聚类分组应视为转录组分层而非临床验证亚型等。未来需要进一步的机制和功能研究来验证这些候选基因在PAH中的作用。
