板栗（Castanea mollissima）GATA转录因子基因家族的全基因组鉴定及盐胁迫响应关键调控因子的解析

《Frontiers in Plant Science》：Genome-wide analysis of the GATA gene family in Castanea mollissima reveals key regulators involved in salt stress response

　　

： GATA基因家族包含重要的转录因子（transcription factors, TFs），影响植物个体发育及非生物/生物胁迫耐受性。板栗（Castanea mollissima）是北半球重要的经济和粮食树种，以其强大的抗风能力和土壤固持能力而著称。然而，现有研究尚未探索板栗中GATA家族的特征和功能。该研究从板栗N11–1参考基因组组装中鉴定出21个CmGATA基因，分布于12条染色体上。系统发育分析将这些基因划分为四个不同的亚家族，属于同一亚家族的基因在结构特征和保守基序组成方面表现出相当大的相似性。共线性分析进一步揭示，CmGATA基因家族扩增的主要驱动力是片段重复（segmental duplication），随后进化压力主要以纯化选择（purifying selection）为主。表型指标如抗氧化酶活性表现出显著变化，转录组分析显示随着盐胁迫处理的持续，差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）数量逐渐增多。值得注意的是，转录组分析揭示了盐胁迫下CmGATA基因的表达模式，结合其与表型指标的相关性及加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA），有效促进了探索CmGATA基因在板栗盐胁迫响应中的功能。此外，利用逆转录定量聚合酶链反应（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）进行的验证实验表明，基因表达趋势与RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）分析结果一致。该研究在理论上有助于理解CmGATA基因在盐胁迫下的进化和功能，为环境保护和盐碱地改良提供了潜在应用价值。提高板栗的耐盐性可支持其在更广泛地区的栽培，将水土保持的生态效益与经济效益相结合。

论文解读文章

一、研究背景与问题提出

转录因子（transcription factors, TFs）是一类能够通过激活或抑制靶基因转录来调控植物生长发育和胁迫响应的DNA结合蛋白。在植物中，WRKY、MYB、NAC和bHLH等多个转录因子家族已被系统表征。GATA转录因子在植物中广泛分布，具有IV型锌指结构域（CX₂CX_17-20CX₂C）及相邻的碱性区域。在被子植物中，GATA基因被分为四个亚组，其中三个亚组的锌指环含有18个残基，一个亚组含有20个残基。这些锌指蛋白能够识别特定的顺式作用元件，从而动态调控基因表达。

研究人员已在多种植物物种中发现该家族的成员，包括大豆（Glycine max，64个）、小麦（Triticum aestivum，79个）、黄瓜（Cucumis sativus，26个）、辣椒（Capsicum annuum，28个）、甜瓜（Cucumis melo，24个）、甜橙（Citrus sinensis，24个）和毛果杨（Populus trichocarpa，39个）。研究表明，GATA转录因子对植物个体发育和非生物/生物胁迫耐受性具有重要影响。例如，拟南芥中的GNC通过直接结合靶基因并招募染色质重塑复合物，动态调控组蛋白修饰和DNA甲基化，从而整合环境信号与发育过程并控制开花时间；茶树中的CsGATA17在高氮条件下作为转录激活子直接上调CsAlaDC表达，促进茶氨酸生物合成；水稻中的OsGATA12通过其锌指结构域抑制叶绿素降解基因，延缓叶片衰老并调控分蘖；小麦中的TaGATA62和TaGATA73通过锌指结构域与光信号蛋白互作，调节抗氧化酶活性，维持氧化还原稳态并增强酵母和拟南芥的干旱及盐胁迫耐受性。

板栗（Castanea mollissima）是壳斗科（Fagaceae）落叶树种，因其营养丰富的果仁而成为北半球重要的粮食和经济作物。然而，其生产力和产业发展受到温度、干旱、盐碱及栗瘿蜂（Dryocosmus kuriphilus）侵害等多种环境胁迫的严重制约。板栗主要栽培于山区和荒地，土壤盐渍化/碱化可严重影响其生长和生产力。近期板栗全基因组研究已开始阐明非生物胁迫响应的分子机制，包括谷氧还蛋白（glutaredoxin, GRX）基因家族和醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase, ALDH）超家族，两者均与盐胁迫响应相关。然而，在其他植物物种中发挥盐胁迫响应关键作用的GATA转录因子家族，在板栗中仍未被探索。鉴于GATA转录因子家族在介导植物对盐碱条件的响应和适应中的关键作用，系统表征板栗中的这些基因对于揭示其在耐盐性中的潜在影响至关重要。

二、研究内容与主要结论

该研究对板栗GATA基因家族进行了系统鉴定和全面分析，涵盖蛋白质理化特性、进化关系、基因组结构、顺式调控元件、转录因子调控网络和基因重复模式。为阐明板栗盐胁迫响应的分子机制，研究人员对植株进行盐处理，随后测定转录组谱和包括抗氧化酶活性在内的生理参数。结合加权基因共表达网络分析（WGCNA），研究揭示了部分CmGATA基因表达与盐胁迫下生理变化之间的明确联系。

三、关键技术与方法

研究人员从板栗基因组数据库获取N11–1参考基因组组装数据，利用30条拟南芥GATA蛋白序列进行BLAST搜索（E值阈值1e?5，序列一致性≥30%），结合Pfam数据库（PF00320）和HMMER 3.0软件筛选候选蛋白，并通过NCBI-CDD和SMART数据库验证保守GATA结构域。系统发育分析采用MEGA 7.0软件的最大似然法（maximum likelihood, ML）构建板栗、拟南芥和水稻GATA蛋白的系统发育树。基因重复事件通过MCScanX软件分类，共线性分析涵盖板栗与拟南芥、夏栎、番茄、葡萄、玉米、水稻和白梨七个物种。实验材料为板栗品种“燕山早丰”，生长60天后，三株植物接受200 mmol/L NaCl溶液处理，另三株接受常规灌溉作为对照，每10天处理一次。生理参数包括土壤电导率（EC）、叶片颜色参数（L、a、b*）、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性及脯氨酸含量，分别在第0、14和26天测定。RNA-seq数据已存入NCBI（Bioproject PRJNA1363574），使用HISAT2比对、FeatureCounts定量、DESeq2鉴定差异表达基因（|log₂ fold change| ≥ 1，FDR < 0.05）。RT-qPCR验证以Actin为参考基因，采用2^?ΔΔCt法计算相对表达量。

四、研究结果

（一）CmGATA基因的分子特征与进化关系

研究在板栗基因组中鉴定出21个GATA基因。CmGATA蛋白含有132（CmGATA18）至544（CmGATA26）个残基，分子量为14.50 kDa（CmGATA16）至60.38 kDa（CmGATA26）。理化分析预测所有CmGATA蛋白均为不稳定的疏水蛋白，平均亲水指数低于零，不稳定指数高于40。亚细胞定位预测所有CmGATA蛋白定位于细胞核。二级结构预测表明随机卷曲是主要结构组分，平均占82.09%。基于板栗、拟南芥和水稻GATA蛋白序列构建的系统发育树将CmGATA蛋白分为四个亚家族，其中亚家族I含11个成员最多，亚家族III含5个，亚家族II含4个，亚家族IV仅含1个成员。

（二）CmGATA基因的结构特征

所有CmGATA蛋白序列均含有一个保守的GATA结构域。系统发育分析揭示亚家族III成员含有额外的CCT和TIFY结构域，亚家族IV成员含有DEUBAD_NFRKB结构域。CmGATA基因含有1至10个内含子，其中亚家族III内含子最多（平均7.8个），亚家族I和II较少（平均1.7个）。所有CmGATA蛋白共享基序1和5，对应GATA结构域。亚家族I、II和IV的锌指环含有18个残基，而亚家族III含有20个。“LCNACG”等氨基酸位点高度保守，符合其他植物GATA蛋白的特征。

（三）CmGATA基因的重复分析

21个CmGATA基因在12条染色体上分布不均，其中8、11和12号染色体各含3个基因。通过MCScanX软件分类，8个CmGATA成员源于片段重复，7个源于分散重复，2个源于全基因组重复（WGD），2个源于串联重复，2个源于近端重复。所有CmGATA同源基因对的Ka/Ks值均小于1，表明其受到有效的纯化选择。

（四）GATA基因家族的跨组装保守性

为评估潜在的组装特异性偏差，研究人员将GATA基因鉴定扩展到板栗的七个基因组组装（N11-1、HBY2、HSZ7、Sun、Vanuxem、YH和YSZS），鉴定出的GATA基因数量为21至25个不等。系统发育分析表明核心GATA基因补体在不同组装间基本保守，证实N11–1组装中鉴定的21个CmGATA基因代表板栗GATA家族的核心规模。

（五）GATA家族的基因组共线性与基因保留模式

板栗与七个代表性物种的共线性分析鉴定出大量含CmGATA的同源基因对：夏栎（12对）、白梨（27对）、葡萄（22对）、拟南芥（21对）、番茄（32对）、水稻（6对）和玉米（2对）。CmGATA7和CmGATA18在多个物种中保留了更多基因拷贝，表明其可能在复杂分子或信号通路中发挥重要作用。CmGATA基因与双子叶植物形成的同源基因对多于单子叶植物，表明单子叶-双子叶分化后CmGATA基因可能经历了额外的重复事件。

（六）启动子分析与功能注释

在21个CmGATA基因的启动子中鉴定出529个顺式作用元件，分为激素响应、环境胁迫相关、发育相关和光响应四类。脱落酸响应元件（ABRE）、茉莉酸甲酯响应元件（CGTCA）和光响应元件（Box4和G-box）几乎存在于所有CmGATA启动子中。预测有612个属于43个转录因子家族的转录因子可能调控CmGATA启动子，其中ERF家族成员最多（80个），其次为MYB（67个）、NAC（59个）、WRKY（43个）和bZIP（35个）。KEGG富集分析显示CmGATA基因主要富集于“转录因子”和“蛋白质家族：遗传信息处理”，GO富集分析突出“RNA聚合酶II转录调控”、“转录正调控”和“非生物刺激响应”。

（七）盐胁迫下板栗的形态与生理特征

200 mmol/L NaCl溶液灌溉后，处理组土壤电导率从0.09显著升至第14天的2.11和第26天的3.70 mS/cm，而对照组保持稳定（0.16–0.22 mS/cm），表明盐胁迫有效施加。盐胁迫显著影响板栗形态，主要引起植株顶部叶片萎蔫。叶片颜色参数L和b在处理26天后显著增加。SOD活性从848.97升至第14天的928.94和第26天的956.18 U/g，CAT活性从183.66升至292.39和332.23 U/g。脯氨酸含量从42.26显著增至第14天的50.00和第26天的72.28 μg/g。MDA含量从52.23 nmol/g升至第14天的67.86和第26天的79.13 nmol/g，表明板栗植株遭受持续的氧化损伤。

（八）RNA测序、DEG鉴定与WGCNA

从盐胁迫第14天（D14T）和第26天（D26T）及对应对照组（D14CK和D26CK）采集叶片样本，构建12个cDNA文库，每个实验条件三个生物学重复。测序共获得98.36 Gb高质量清洁读段，Q20和Q30值分别高于99%和97%，比对率介于91.46%至91.78%之间。比较分析鉴定出10,410个DEGs，其中D14T vs. D14CK比较鉴定出2,499个上调基因和2,069个下调基因，D26T vs. D26CK比较鉴定出3,526个上调基因和3,715个下调基因，DEG数量与盐胁迫持续时间正相关。WGCNA鉴定出13个与不同表型指标显著相关的模块。黄色模块与SOD活性（r = ?0.95）、CAT活性（r = ?0.99）和MDA含量（r = ?0.98）呈负相关，青绿色模块与SOD活性（r = 0.93）、CAT活性（r = 0.97）、MDA含量（r = 0.98）和脯氨酸含量（r = 0.94）呈正相关。功能富集显示黄色模块与光合作用、色素生物合成和能量代谢相关，青绿色模块主要与蛋白质加工、囊泡介导转运和内膜系统组织相关。CmGATA5、CmGATA8a、CmGATA32、CmGATA25b和CmGATA28c定位于黄色和青绿色模块中，表明其与板栗耐盐性密切相关。

（九）CmGATA基因与表型指标的相关性及RT-qPCR验证

多个CmGATA基因在对照和盐胁迫条件下表现出显著差异表达。CmGATA5、CmGATA28c、CmGATA25a和CmGATA28b在盐胁迫下显著诱导表达，其中CmGATA5的FPKM值在14天后从76.77升至98.34，26天后从56.23升至112.72。相反，CmGATA18和CmGATA28c等基因在盐胁迫下表达显著降低。相关性分析显示，CmGATA28c与MDA和脯氨酸含量呈显著正相关，而CmGATA25b和CmGATA12a与SOD、CAT活性和MDA含量呈负相关。RT-qPCR验证了四个在盐胁迫下表达显著变化的CmGATA基因，结果与转录组数据高度一致，证实了CmGATA基因在板栗盐胁迫下调控模式的可靠性。

五、讨论与结论

该研究首次全面分析了板栗GATA基因家族，揭示了其在盐胁迫响应中的潜在作用。CmGATA蛋白表现出与甜橙和甜瓜等植物GATA蛋白相似的理化性质。亚家族III成员含有的CCT结构域可整合光信号和昼夜节律，TIFY结构域通过茉莉酸信号协调胁迫响应与发育之间的平衡。亚家族I和II成员内含子较少且较短，通常与较高的基因表达水平相关，且内含子贫乏的基因在拟南芥中常响应干旱和盐胁迫。

GATA基因家族起源于单细胞真核生物。板栗中鉴定出的21个CmGATA基因少于大豆（64个）和毛果杨（39个），但与水稻（28个）和黄瓜（26个）相当。片段重复和分散重复是CmGATA基因家族扩增的主要驱动力。板栗与双子叶植物间的共线性关系明显强于与单子叶植物，但共线性块的数量和长度与物种间进化距离无显著相关，这可能源于不同植物物种在不同生态压力下的基因组重排。

盐胁迫下多个CmGATA基因表达显著变化，表明其参与板栗盐响应调控。CmGATA基因启动子中含有丰富的ABRE、LTR和MBS等与非生物胁迫响应及激素信号相关的顺式作用元件。研究人员假设盐胁迫激活ERF、MYB、NAC和WRKY等转录因子，这些转录因子随后调控特定CmGATA基因，CmGATA蛋白再与其他因子互作，共同调控参与氧化胁迫防御和渗透调节的下游效应因子，最终形成增强板栗盐胁迫适应的转录调控级联。

研究结论：在系统鉴定板栗GATA转录因子家族后，该研究全面分析了其分子特征、进化扩增和盐胁迫下的调控。研究结果揭示了CmGATA基因的基本特征，并提供了支持其在盐胁迫响应中关键作用的充分证据。具体而言，CmGATA5和CmGATA28c是通过过表达或基因编辑方法进行功能验证的优先候选基因。这些结果为板栗耐盐性的未来遗传改良奠定了基础。