整合代谢组与单细胞分析揭示子宫腺肌病中赖氨酸巴豆酰化相关上皮重塑及SDC4失调

《Frontiers in Nutrition》：Integrated metabolomic and single-cell analyses reveal crotonylation-related epithelial remodeling and SDC4 dysregulation in adenomyosis

　　

背景：子宫腺肌病（adenomyosis，AM）以异位子宫内膜侵入和子宫肌层纤维化为特征，然而局部代谢重塑、赖氨酸巴豆酰化（Kcr）与上皮功能障碍之间的分子联系仍知之甚少。研究人员研究了AM的代谢与巴豆酰化相关景观，并试图识别与这些改变相关的上皮分子特征。方法：将临床代谢谱、公共及新生成的组织代谢组学数据、巴豆酰辅酶A（crotonyl-CoA）测量和组织巴豆酰化检测与单细胞及批量转录组分析整合。使用多种基因集评分方法和共表达分析表征Kcr相关转录模式，随后进行多算法特征优先级排序。通过轨迹推断、细胞间通讯分析、转录因子预测和计算机扰动进一步检查SDC4相关上皮状态。结果：校正后的临床分析未显示循环脂质谱的稳健差异，而组织水平代谢组学分析揭示AM中脂质和赖氨酸相关代谢物改变。AM组织中巴豆酰辅酶A（crotonyl-CoA）估计值较高，伴随H₃K¹⁸cr增加。在单个免疫沉淀（IP）比较中也观察到较高的p65相关Kcr信号；鉴于每组仅有一个IP测量值，这一发现应被视为初步描述性观察。单细胞分析在上皮细胞中识别出显著的Kcr相关转录模式，并将该状态与黏附、连接组织和上皮重塑联系起来。SDC4在五种机器学习流程中一致被优先选择，并主要在上皮细胞群体中表达。SDC4⁺上皮细胞表现出不同的推断分化状态和细胞间通讯模式，而计算扰动进一步提示SDC4相关网络参与上皮黏附、细胞骨架组织和连接调控。结论：这些发现将局部代谢重塑和巴豆酰化相关改变与AM中明显的上皮转录状态联系起来，并确定SDC4为与上皮重塑相关的持续优先候选。初步的p65相关Kcr观察为研究Kcr、p65和SDC4相关上皮程序之间潜在关联提供了额外背景。

研究背景：子宫腺肌病（adenomyosis，AM）是常见良性妇科疾病，病理特征为子宫内膜腺体和间质存在于子宫肌层内，并伴周围肌层纤维化和平滑肌肥大，涉及子宫内膜-肌层界面异常。该病多见于育龄女性，临床表现包括进行性继发性痛经、月经过多和慢性盆腔痛，可损害生育和生活质量。现有激素治疗或保宫手术多仅缓解症状且复发率高；子宫切除为确定性治疗，但不适合希望保留生育或子宫者，因此亟需更精确的治疗靶点。其分子过程涉及上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）重塑、蛋白酶分泌增加及成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。近年来细胞代谢与表观遗传调控受到关注，赖氨酸巴豆酰化（Kcr）为四碳不饱和酰基修饰，可被染色质阅读器识别并影响转录；巴豆酰辅酶A（crotonyl-CoA）可影响p300催化的组蛋白巴豆酰化。AM组织高度异质，批量转录组可能掩盖稀有上皮亚群信号，因此研究人员整合临床再分析、组织代谢组、crotonyl-CoA免疫测定、组织Kcr检测及单细胞和批量转录组，探索局部代谢重塑、Kcr相关改变与上皮功能障碍之间的联系，并优先分析SDC4。研究人员得出AM存在局部脂质和赖氨酸相关代谢改变、crotonyl-CoA免疫信号和H₃K¹⁸cr升高、上皮Kcr相关转录状态以及SDC4优先候选，提出可检验的Kcr-p65-SDC4关联框架；其意义在于将局部代谢重塑、巴豆酰化相关改变和SDC4相关上皮重塑联系起来，但因果或机制关系仍需验证。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员整合152例临床队列（76例AM、76例对照）、公开OMIX007190子宫内膜代谢组（56例AM、97例健康对照）、新测组织中心代谢面板（每组6例）和crotonyl-CoA酶联免疫吸附测定（ELISA，每组7例）。单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据来自GSE218044和GSE214411（4例AM、7例对照）；批量转录组合并GSE68870、GSE78851、GSE171653、GSE185392、GSE190580、GSE193928、GSE244236，共164例（89例AM、75例对照）。采用Kcr相关基因集多评分、高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）、基因集变异分析（GSVA）、GO/KEGG、五种机器学习、CytoTRACE、Monocle、CellChat、NetworkAnalyst、scTenifoldKnk和scMetabolism；并以Western blot、H₃K¹⁸cr、p65免疫沉淀（IP）和免疫组织化学（IHC）验证组织蛋白。

研究结果：
1. AM与Con临床基线特征及代谢指标比较：152例回顾性分析中，AM年龄、BMI、子宫体积、痛经年限较高；未校正时总胆固醇、甘油三酯、LDL-C、ALT、AST较高而血红蛋白较低；校正年龄、产次、子宫肌瘤、盆腔炎性疾病和近期激素使用后，血脂及ALT/AST/血红蛋白差异未获统计学支持，促使研究转向组织水平。
2. 公共子宫内膜代谢组学支持局部脂质和赖氨酸相关重塑：OMIX007190重分析显示AM中赖氨酸、5-氨基戊酸、5-羟基赖氨酸、肉碱、硬脂酸、棕榈酸升高，Sph(d18:2)、十六碳烯二酰肉碱、2-羟基硬脂酸、LPE(16:0)、PC(40:8)降低，提示脂质和赖氨酸相关代谢双向改变，而非脂质合成一致增加。
3. 新组织测量提供探索性代谢和crotonyl-CoA相关证据：新测中心代谢面板中谷氨酸、AMP、ADP、3-磷酸甘油酸、2-磷酸甘油酸在AM几何均值较高；乙酰辅酶A和戊二酰辅酶A未可定量。crotonyl-CoA免疫测定中AM高于对照（1.771±0.698 vs 1.015±0.229 ng/ml，P=0.0286）。
4. AM与Con的单细胞转录组景观：scRNA-seq鉴定六类主要细胞，包括基质、血管内皮、T/NK、淋巴内皮、单核/巨噬和上皮细胞；细胞比例和差异表达提示微环境重塑，上皮富集于分化、黏附和结构完整性。
5. AM中单细胞Kcr相关转录景观的特征：36个Kcr相关基因五算法评分显示异质性，复合评分在上皮最高，高评分细胞富集于上皮，T/NK多低评分；高/低评分差异基因包括PAEP和SLC15A1。
6. 单细胞共表达网络的构建：hdWGCNA软阈值8得到11个模块，绿色和紫色模块富集上皮，棕色模块富集基质，蓝色模块富集淋巴内皮，并提名模块hub基因。
7. Kcr评分相关特征基因的鉴定和功能富集：高评分上调基因与kME>0.4模块成员交集得到106个特征；GSVA显示AM与对照上皮通路差异；GO/KEGG富集涉及上皮形态发生、连接组织、顶端/基底区域、顶端连接复合体、细胞间黏附介质活性、钙黏蛋白结合。
8. 使用多种机器学习算法对AM特征进行探索性优先级排序：89个候选进入训练集；LASSO、Random Forest、SVM-RFE、XGBoost、Boruta分别得到2、20、40、18、16个基因；SDC4被五种方法一致选择，WFDC2仅被LASSO和SVM-RFE选择。
9. 优先特征的bulk表达比较和单细胞定位：合并bulk中SDC4（P=0.005）和WFDC2（P=0.02）在AM较高；单细胞定位显示二者主要在上皮，SDC4在免疫和内皮低或检测不到、上皮丰富、基质中等，WFDC2广泛但上皮最强。
10. SDC4⁺与SDC4^?上皮细胞推断分化轨迹和CellChat模式：CytoTRACE显示SDC4⁺评分较高，提示较SDC4^?更少分化；Monocle将许多SDC4⁺置于轨迹早期。CellChat预测SDC4⁺传入和传出通讯更广，通路涉及LIFR、CALCR、COMPLEMENT、GDF、SPP1、GALECTIN、BMP、PERIOSTIN、EGF、GRN、PARs、CypA等，并提名多组配体-受体对。
11. WFDC2⁺与WFDC2^?上皮细胞推断分化轨迹和CellChat模式：WFDC2^?分布高低CytoTRACE区域，WFDC2⁺集中轨迹中后期；伪时间显示早期ADGRF1、GPX3、ANXA4、PAX8、SPP1、CXCL14、S100P，晚期RPS/RPL、COL3A1、SFRP4、HSPA1A、SPDEF。CellChat估计WFDC2⁺总体通讯更强，但方向性通讯有差异。
12. 候选转录因子分析和组织水平蛋白评估：NetworkAnalyst提名RELA/p65及其他NF-κB家族为SDC4候选调控因子。Western blot和IHC描述性显示SDC4、p65、Pan-Kcr、WFDC2、P-FAK、P-Smad3组织模式；H₃K¹⁸cr/总H₃在AM为对照1.94倍（每组3例，P=0.0161）。p65免疫沉淀中Pan-Kcr/IP-p65在AM标本为对照3.086倍，但每组仅1个IP，为初步描述性观察。
13. scTenifoldKnk预测的SDC4相关转录变化：计算机SDC4扰动预测ATOH8、ADGRF1、RXFP1、GABRP等网络状态改变；GO/KEGG/Reactome富集涉及上皮发育、伤口愈合、基底质膜、黏附连接、钙黏蛋白/S100/肌动蛋白结合、紧密和黏附连接、RHO GTPase循环、SLC2A4/GLUT4转位和中性粒细胞脱颗粒。这些为网络预测。
14. AM中转录组推断的代谢通路重塑：scMetabolism显示AM上皮中赖氨酸降解、D-谷氨酰胺/D-谷氨酸代谢、组氨酸代谢、泛酸/CoA生物合成、脂肪酸生物合成评分较高，丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生、三羧酸循环（TCA循环）较低；赖氨酸降解、色氨酸代谢、氧化磷酸化、泛酸/CoA生物合成随Kcr评分组升高。这些为基因表达评分，不直接测代谢物丰度或通量。

讨论总结：研究人员整合临床、代谢组、生化和转录组证据，强调AM局部组织代谢重塑，而非全身代谢异常；组织代谢物、crotonyl-CoA免疫信号、H₃K¹⁸cr和上皮Kcr相关转录状态汇聚；SDC4最一致优先，与黏附、连接、细胞骨架和分化程序相关；RELA/p65为候选调控因子，p65相关Kcr初步观察提供背景。原文提出两种非互斥可能：组蛋白Kcr影响转录许可，或p65复合物内Kcr影响信号；但未定位H₃K¹⁸cr至SDC4启动子，也未鉴定p65位点。WFDC2为次要候选。局限包括组织样本小、单IP测量、乙酰辅酶A/戊二酰辅酶A不可定量，计算扰动需功能验证。
研究结论翻译：研究人员的整合代谢组、生化和转录组分析描绘了AM局部代谢和巴豆酰化相关重塑景观。这些改变汇聚于一个明显的上皮转录状态，其特征在于黏附、连接组织和细胞间信号失调，SDC4成为持续优先的上皮特征。伴随的H₃K¹⁸cr和p65相关Kcr信号进一步为研究代谢重塑如何与AM上皮调控程序相互作用提供分子背景。总体而言，这些发现支持一个关联框架，连接局部代谢重塑、巴豆酰化相关改变和SDC4相关上皮重塑。所提出的Kcr-p65-SDC4关联模型需在独立队列和专门功能研究中验证，才能建立因果或机制关系。