全外显子组测序揭示汉族人群抗结核药物性肝损伤易感性的罕见变异累积负荷

《Frontiers in Pharmacology》：Whole-exome sequencing reveals cumulative rare variant burden associated with susceptibility to anti-tuberculosis drug-induced liver injury in a Han Chinese cohort

背景： 抗结核药物性肝损伤（anti-tuberculosis drug-induced liver injury, AT-DILI）发生于2%-28%的结核病治疗过程中，限制了治疗方案的实施，偶尔还会导致急性肝衰竭。已知的遗传因素尚不能完全解释个体间的易感性差异。 方法： 研究人员对一个AT-DILI队列进行了整合的全外显子组测序（whole-exome sequencing, WES）分析，结合了常见变异关联分析、基因和通路水平的罕见变异负荷检验以及探索性的基因型-表型分析。进一步在一个匹配的子队列中分析了遗传变异与DNA甲基化之间的顺式遗传-表观遗传关联。 结果： 罕见变异负荷分析将PTGS1列为候选易感基因（SKAT-O P = 4.58 × 10-4，富集比 = 3.461），在AT-DILI病例中观察到罕见功能变异的负荷增加。通路水平的负荷分析进一步表明，与外源物代谢、免疫调节和细胞应激反应（包括受调控的细胞死亡）相关的生物学过程存在富集。在一个匹配的子队列（n = 28）中进行的顺式遗传-表观遗传关联分析，在GPR132位点发现了一个名义上的关联信号，提示遗传变异与DNA甲基化之间存在潜在关系。此外，基因型-表型分析显示，S100A2基因的罕见变异负荷与丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）峰值水平呈名义上的正相关。 结论： 这些发现对AT-DILI中的候选罕见变异信号及相关生物学过程提供了整合的特征描述。研究结果优先将PTGS1及其他候选位点列为深入研究的对象，并拓展了研究人员对抗结核治疗结局个体间差异潜在遗传因素的理解。

一、研究背景与研究目的

结核病（tuberculosis, TB）治疗常因抗结核药物性肝损伤（anti-tuberculosis drug-induced liver injury, AT-DILI）而复杂化，这是限制治疗的最常见严重不良事件。AT-DILI发生率约为2%-28%，在不同人群和临床定义下存在显著异质性。尽管多数病例表现为无症状的血清转氨酶升高或有症状的肝炎，但少数可能进展为急性肝衰竭（acute liver failure, ALF），在没有肝移植的情况下死亡率很高。显著的个体间和群体间易感性差异暗示宿主遗传因素是风险的关键决定因素。东亚人群的发生率持续高于西方人群，提示存在人群特异的遗传结构。

既往针对AT-DILI的遗传学研究主要集中于药物代谢酶的常见变异，如NAT2和CYP2E1，这些基因已被一致证明与异烟肼（isoniazid, INH）诱导的肝毒性相关。然而，全基因组关联研究（genome-wide association study, GWAS）在AT-DILI中未能发现新的免疫信号，很大程度上复制了已知的候选基因关联，部分原因是样本量有限。因此，除了NAT2的强信号外，其他已鉴定的常见变异效应量较小。

罕见功能变异通常比常见多态性具有更大的生物学效应，可能解释了GWAS未能捕获的大量遗传力缺失。全外显子组测序（whole-exome sequencing, WES）结合基于基因的负荷检验，为检测功能相关位点上罕见有害变异的累加效应提供了一个分析框架，从而补充了基于常见变异的关联分析方法。此外，表观遗传修饰，特别是DNA甲基化，已被证明在肝毒性反应中发挥关键中介作用。重要的是，越来越多的证据表明，遗传变异可以通过顺式调控效应塑造局部DNA甲基化，这种遗传-表观遗传相互作用已在人类肝细胞的药物代谢相关位点被观察到。然而，AT-DILI易感位点的罕见变异负荷是否对DNA甲基化产生可测量的顺式调控效应，仍是DILI发病机制中一个未被探索的维度。

在本研究中，研究人员在一个特征明确的汉族AT-DILI病例-对照队列中开展了遗传学和表观遗传学联合研究。利用WES数据，系统地探究了常见变异关联以及基因和基因集的罕见变异负荷，以优先筛选可能与肝毒性易感性相关的候选遗传信号和生物学过程。在一个同时具有DNA甲基化谱的子队列中，进一步开展了探索性的顺式遗传-表观遗传关联分析，以研究优先筛选位点上罕见遗传变异与局部表观遗传模式之间的潜在关系。这些分析旨在提供AT-DILI易感性遗传因素的多层次特征描述，并为未来抗结核治疗中的基因组风险分层提供一个支撑框架。

二、主要关键技术方法

研究人员从先前建立的AT-DILI队列中纳入143例病例和273例来自独立人群队列的对照个体，提取外周血基因组DNA后使用Agilent SureSelect Human All Exon V8试剂盒构建文库并在Illumina NovaSeq 6000平台进行全外显子组测序。序列比对至GRCh38/hg38参考基因组，采用GATK HaplotypeCaller流程进行联合变异检出，并通过Variant Quality Score Recalibration（VQSR）和硬过滤确保变异质量。主成分分析（principal component analysis, PCA）用于控制群体分层。常见变异（MAF≥1%）通过PLINK软件采用加性逻辑回归模型进行分析。罕见变异（MAF<0.005）的基因水平关联分析采用KGGSeq软件中的Combined Multivariate and Collapsing test（CMC）、Price burden test（PRICE）和Sequence Kernel Association Optimized test（SKAT-O）三种互补方法。基因集水平关联分析利用分子特征数据库（Molecular Signatures Database, MSigDB）C2集合中3-300个基因的通路，通过RVtests软件的Sequence Kernel Association Test框架进行置换检验。在28例具有匹配WES和DNA甲基化数据的子队列中，通过Spearman秩相关评估候选基因内±500 kb窗口的CpG位点甲基化水平与罕见变异携带状态的关联。

三、研究结果

3.1 研究人群与临床特征：初始队列包含143例AT-DILI病例和273例对照，经过样本层面质量控制后保留139例病例和269例对照。病例与对照在前两个主成分上基本重叠，表明遗传祖先可比且无明显群体亚结构。

3.2 遗传结构与常见变异关联分析：对119,795个常见变异（MAF≥1%）进行检验，基因组膨胀因子λ_GC为1.049，表明群体分层得到良好控制。共5个变异达到提示性显著水平（P<1×10^-6），其中PSPH基因的一个同义变异（rs75497420，OR=3.23，P=1.52×10^-7）显示出最稳定的关联。对于既往报道的NAT2基因，预测慢乙酰化频率在病例组为17.3%、对照组为15.2%，虽未通过多重检验校正，但其与既定药理遗传学机制的一致性为后续罕见变异分析提供了支持性背景。

3.3 罕见变异负荷优先筛选候选易感基因：基因水平关联分析显示，PTGS1基因信号最为一致（P_SKAT-O=4.59×10^-4），病例组罕见变异等位基因数多于对照组（13 vs. 7，富集比=3.46）。CHUK（IKK-α）基因富集比为10.68（7 vs. 1，P_SKAT-O=2.46×10^-3），NLRC5基因富集比为4.99（11 vs. 4，P_SKAT-O=4.99×10^-3）。PIEZO1和SLC2A12也表现出跨模型一致的富集。在PTGS1和CHUK中发现的罕见变异在东亚人群参考数据库中大多为极稀有或缺失，支持这些基因水平信号源于群体中耗竭的罕见变异富集。

3.4 优先筛选基因PTGS1和CHUK中罕见变异的结构注释：在PTGS1基因中共鉴定出12个罕见蛋白改变变异，包括11个错义替换和1个移码插入。p.G65S位于表皮生长因子样（EGF-like）结构域和膜结合结构域（MBD）的交界处，p.A526S定位于催化残基Ser530（阿司匹林乙酰化位点）附近。CHUK基因的多个变异聚集于N端激酶结构域，其中p.G208R和p.E148K影响进化保守残基且具有高预测有害性评分。

3.5 罕见变异相关基因的网络分析与DILI相关功能模块：通过STRING v12.0构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，整合优先筛选的负荷基因与已确立的DILI相关基因。KEGG通路富集分析显示，主要模块富集于外源物代谢和肝脏解毒通路（如细胞色素P450的药物代谢），次要模块富集于炎症和免疫调节通路（如TNF信号和IL-17信号）。CHUK在网络拓扑中处于炎症和应激反应亚网络的界面位置。

3.6 通路水平负荷分析揭示AT-DILI中罕见变异富集的生物学过程：基于MSigDB中7,186条通路的基因集关联分析识别出四个功能类别：疾病关联、分子机制、细胞过程和其他调控程序。富集通路包括对乙酰氨基酚代谢、亚油酸代谢、脓毒症中活性氧（reactive oxygen species, ROS）应答、紫外线应激应答、受调控坏死以及FASLG-RIPK1坏死性凋亡信号。免疫相关通路如TGF-β1信号和巨噬细胞病原体清除也存在富集。

3.7 探索性顺式遗传-表观遗传关联提示GPR132位点的潜在关系：在28例匹配子队列中，GPR132位点（chr14:105051371，CADD=23.1）的罕见变异携带状态与±500 kb窗口内的多个近端CpG单位存在关联，包括与探针A_17_P09529823的正相关（ρ=0.4589，P=0.0377）以及与A_17_P16739872（ρ=-0.5007，P=0.0379）和A_17_P16740256（ρ=-0.480，P=0.0547）的负相关。分层分析显示携带者与非携带者之间在这些CpG位点的甲基化状态分布存在差异。

3.8 罕见变异负荷与临床严重程度的关联：S100A2基因的罕见变异负荷与丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）峰值水平呈中度正相关（Spearman ρ=0.23，P=0.0041），携带者相比非携带者表现出更高的肝损伤严重程度（P=0.0198）。

四、讨论总结与研究结论

本研究通过整合常见变异关联、罕见变异负荷检验、通路水平聚合以及探索性表观遗传学分析，在一个特征明确的AT-DILI队列中提供了候选易感信号的系统水平表征。研究发现提示罕见功能变异可能汇聚于代谢、免疫和细胞应激反应通路。PTGS1（编码COX-1）作为排名最高的候选易感基因，其编码的前列腺素E₂（PGE₂）已被证明通过维持线粒体完整性、减弱促凋亡信号和调节巨噬细胞介导的炎症反应发挥肝脏保护作用。在通路水平，外源物代谢、脂质代谢和炎症调控相关通路的富集为解读罕见变异负荷信号提供了额外的生物学背景。CHUK和NLRC5等免疫信号基因以及受调控坏死和坏死性凋亡信号通路的共富集，反映了严重肝细胞应激期间激活的已知细胞死亡级联反应。S100A2罕见变异负荷与ALT峰值的探索性关联提示罕见遗传变异可能与生化损伤严重程度的个体间差异有关。GPR132位点的顺式遗传-表观遗传关联为罕见遗传变异与局部DNA甲基化模式之间的可能关系提供了初步证据。

研究局限性包括：样本量相对较小限制了统计效力，特别是对于罕见变异和表观遗传分析；使用外周血进行甲基化分析可能无法完全捕捉肝脏特异性的调控过程；缺乏功能性验证；缺乏关于伴随用药（尤其是靶向COX-1通路的非甾体抗炎药）的详细纵向信息；研究队列仅限于汉族人群，候选标志物在不同祖先人群中的普适性尚不确定。

研究结论：本研究为AT-DILI的遗传易感性提供了整合评估。通过整合多层次遗传学、通路水平和表观遗传学分析，研究结果为理解药物性肝损伤个体间差异提供了一个支持性的系统水平框架。这些见解最终可能有助于改进结核病治疗中的风险分层和更安全的治疗策略。