焦磷酸测序法用于间日疟原虫Pvmdr1多态性联合基因分型及氯喹抗性遗传变异的分子监测

《Malaria Journal》：Development and evaluation of a pyrosequencing assay for Plasmodium vivax Pvmdr1 genotyping

摘要

背景

可靠地检测Pvmdr1多态性可以为与间日疟原虫氯喹敏感性改变相关的遗传变异的分子监测提供支持。然而，传统的基因分型方法对于混合基因型感染中的次要等位基因可能具有有限的灵敏度。本研究旨在开发并验证一种用于Pvmdr1单核苷酸多态性联合基因分型的焦磷酸测序方法。

方法

开发了一种靶向Pvmdr1第958、976和1076密码子的焦磷酸测序方法。使用人工野生型和突变型DNA混合物来评估Y976F和F1076L的预期突变等位基因比例与观察到的突变等位基因比例之间的关系。使用一组单独的包含49例临床分离株的验证集，评估焦磷酸测序与既往产生的Sanger测序结果在基因型分类方面的一致性。将该方法应用于2023年至2025年间在泰国北碧府收集的147例独立的P. vivax分离株。

结果

该方法显示Y976F（R² = 0.9852）和F1076L（R² = 0.9829）的预期等位基因比例与观察到的等位基因比例之间呈近似线性关系。在所测试的单次运行条件下，所有三个技术重复中检测到的最低名义突变比例为：Y976F为30%，F1076L为10%。焦磷酸测序与Sanger测序的一致性在第958、976和1076密码子处分别为98.0%、100.0%和93.9%。在147例P. vivax分离株中，M958突变基因型分类在三个采样年度的分离株中占92.5–100.0%。被分类为F976突变的分离株比例从2023年的21.3%降至2025年的1.9%，而F1076L仍保持常见（55.3–62.3%）。三基因座基因型组合（M/Y/L）从2023年占分离株的34.0%增至2025年的79.2%。

结论

该焦磷酸测序方法提供了一种定量检测方法，可用于检测选定的Pvmdr1多态性和混合基因型感染。该方法可为P. vivax在流行地区遗传变异的分子监测提供支持，然而，与氯喹抗性相关的解释需要与临床治疗及表型敏感性数据进行整合。