Sigma-1受体通过恢复NRF2/HO1信号通路缓解C9orf72相关ALS中poly-GR介导的氧化还原失调

《NeuroMolecular Medicine》：Sigma-1 Receptor Mitigates Poly-GR-Associated Redox Dysregulation by Restoring NRF2/HO1 Signaling in C9orf72-Associated ALS

　　

C9orf72基因中的六核苷酸GGGGCC重复扩增会产生富含精氨酸的二肽重复蛋白（DPR），包括poly-GR和poly-PR，这些蛋白与肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）的发病相关。尽管poly-GR已被证实与氧化应激和线粒体功能障碍相关，但在表达poly-GR的运动神经元中，抗氧化防御系统得以保留或被抑制的机制仍不完全清楚。本研究在细胞和小鼠模型中探讨了Sigma-1受体（Sigma-1R）是否调控poly-GR相关的氧化还原失调。在NSC34细胞中，EGFP-PR42和EGFP-GR50的表达均降低了NRF2蛋白水平。EGFP-GR50的表达还伴随NRF1和HO1水平降低以及活性氧（ROS）积累增加。Sigma-1R过表达或使用氟伏沙明（fluvoxamine）或PRE084进行药理学激活，可恢复NRF2和HO1的表达，并减轻EGFP-GR50表达细胞中细胞和线粒体水平的氧化应激。Sigma-1R拮抗剂NE100共处理可减弱激动剂诱导的NRF2和HO1恢复。此外，NRF2抑制剂ML385可减弱激动剂介导的HO1恢复，支持NRF2活性参与这一下游反应。在AAV介导的EGFP-GR50小鼠模型中，Sigma-1R缺失与生存期缩短、NeuN阳性神经元数量减少以及脑中NRF2免疫反应性降低相关。综上，这些发现将Sigma-1R确定为poly-GR相关氧化还原失调和神经元易感性的调节因子，并支持进一步研究Sigma-1R调控作为C9orf72相关ALS潜在治疗策略的可行性。

论文解读

一、研究背景与目的

C9orf72基因中的六核苷酸GGGGCC重复扩增是肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）最常见的遗传病因之一。该重复扩增通过重复相关非AUG（RAN）翻译产生一系列二肽重复蛋白（DPR），其中富含精氨酸的poly-GR和poly-PR毒性最强，已被证实可导致神经元功能障碍和退行性变。既往研究已提出多种机制解释富含精氨酸DPR诱导的神经退行性变，包括核质转运功能障碍、应激颗粒组装异常等，但不同DPR对神经元应激反应通路的差异性影响仍不清楚。

氧化应激是ALS及其他神经退行性疾病中神经元损伤的重要驱动因素。在C9orf72相关ALS/FTD模型中，poly-GR已被证实与线粒体功能障碍、ROS产生增加和运动功能损害相关。NRF2抗氧化通路在维持氧化还原稳态中发挥核心作用，激活NRF2可减轻poly-GR相关的氧化损伤。HO1作为NRF2的经典下游靶基因，是这一抗氧化反应的重要效应分子。然而，poly-GR是否直接抑制运动神经元样细胞中的NRF2/HO1抗氧化轴，以及这种抑制能否被药理学或遗传学手段逆转，此前尚未阐明。

Sigma-1受体（Sigma-1R）是一种富集于内质网的分子伴侣蛋白，在蛋白质稳态、钙信号、线粒体功能和神经元存活中具有既定作用。既往研究表明，Sigma-1R激活可调节与ALS相关的应激反应通路，包括通过Sigma-1R/POM121/TFEB轴增强自噬、保护poly-PR毒性等。此外，Sigma-1R激动剂在不同疾病背景下可促进NRF2核转位和抗氧化信号。然而，Sigma-1R是否通过NRF2/HO1通路调节poly-GR特异性的氧化还原失调，此前尚未明确。本研究旨在探讨Sigma-1R在poly-GR相关氧化还原失调中的作用，并评估其作为C9orf72相关ALS潜在治疗靶点的可行性。

二、主要技术方法

研究人员采用了多层次的实验策略。细胞实验使用NSC34运动神经元样细胞系（CELLutions Biosystems Inc.），通过脂质体转染表达EGFP-PR₄₂或EGFP-GR₅₀融合蛋白，利用流式细胞术评估转染效率，采用蛋白质印迹法（Western blot）检测NRF2、NRF1、HO1等蛋白表达水平，使用CellROX和MitoSOX荧光探针分别检测细胞总ROS和线粒体超氧化物水平，并通过免疫荧光分析NRF2核定位。药理学干预使用了Sigma-1R激动剂氟伏沙明（fluvoxamine）和PRE084、Sigma-1R拮抗剂NE100以及NRF2抑制剂ML385。动物实验方面，研究人员采用AAV9载体介导hSyn-EGFP-GR₅₀表达，通过脑室内注射方式建立新生野生型和Sigma-1R基因敲除（SigmaR1^?/?）C57BL/6J小鼠模型（SigmaR1^?/?小鼠由Dr. Tsung-Ping Su提供），进行生存分析、脑组织免疫荧光检测NeuN阳性神经元数量和NRF2表达水平。

三、研究结果

（1）细胞自主性EGFP-GR₅₀比EGFP-PR₄₂在NSC34细胞中引起更广泛的抗氧化信号抑制

研究人员首先比较了两种富含精氨酸DPR对NSC34细胞抗氧化信号的影响。结果显示，EGFP-PR₄₂主要定位于细胞核和核仁，而EGFP-GR₅₀在细胞质和细胞核中均有分布。流式细胞术证实两种构建体的转染效率相当。Western blot分析显示，与EGFP对照细胞相比，EGFP-PR₄₂和EGFP-GR₅₀均显著降低NRF2蛋白表达，但仅EGFP-GR₅₀显著降低NRF1和HO1水平。免疫荧光分析进一步表明，EGFP-GR₅₀表达显著减少NRF2核内积累，核质比显著降低。这些结果表明EGFP-GR₅₀在蛋白丰度和核定位两个层面损害NRF2信号，产生更广泛的抗氧化反应破坏。

（2）Sigma-1R过表达恢复EGFP-GR₅₀表达细胞中的NRF2/HO1信号并减少ROS积累

研究人员检测了Sigma-1R过表达对EGFP-GR₅₀诱导的氧化还原失调的影响。Western blot分析显示，EGFP-GR₅₀表达降低NRF2、NRF1和HO1水平，而HA标记的Sigma-1R共表达显著恢复NRF2和HO1蛋白水平，但NRF1未获显著恢复。值得注意的是，Sigma-1R过表达本身并未显著改变EGFP对照细胞的基础NRF2表达，排除了非特异性升高的可能。CellROX和MitoSOX染色显示，EGFP-GR₅₀显著增加细胞ROS和线粒体ROS积累，而Sigma-1R过表达显著降低这两种ROS水平。

（3）Sigma-1R激动剂恢复EGFP-GR₅₀表达细胞中的NRF2/HO1信号并减少细胞ROS

研究人员进一步检验了药理学激活Sigma-1R能否重现过表达的保护效应。氟伏沙明和PRE084处理均显著增加EGFP-GR₅₀表达细胞中NRF2和HO1的表达。Sigma-1R拮抗剂NE100可阻断氟伏沙明或PRE084诱导的NRF2和HO1上调，支持Sigma-1R参与该反应。NRF2抑制剂ML385显著减弱激动剂诱导的HO1表达增加，证明HO1恢复依赖于NRF2活性。CellROX和MitoSOX分析显示，两种激动剂均显著降低EGFP-GR₅₀诱导的细胞ROS和线粒体超氧化物水平。此外，在未处理细胞中，两种激动剂也显著降低基础MitoSOX荧光，表明Sigma-1R激动剂在基础条件下即可调节线粒体氧化状态。

（4）Sigma-1R缺失加速体内EGFP-GR₅₀相关的神经退行性变

研究人员利用AAV9-hSyn-EGFP-GR₅₀小鼠模型评估Sigma-1R缺失对poly-GR神经毒性的影响。生存分析显示，SigmaR1^?/?小鼠中位生存期较野生型缩短约16%。体重和脑长度在两组间无显著差异。免疫荧光分析显示，SigmaR1^?/?小鼠运动皮层NeuN阳性神经元数量显著减少，表明Sigma-1R缺失增加EGFP-GR₅₀相关神经元丢失和生存期缩短的易感性。

（5）Sigma-1R缺失降低EGFP-GR₅₀表达小鼠脑中的NRF2表达

研究人员在体内进一步验证Sigma-1R缺失与NRF2信号受损的关联。免疫荧光分析显示，与野生型对照相比，SigmaR1^?/?小鼠脑中NRF2免疫反应性显著降低，定量分析证实NRF2荧光强度显著减少，为Sigma-1R/NRF2轴在poly-GR相关神经退行性变中的保护作用提供了体内证据。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，内源性抗氧化防御的抑制可能促成poly-GR表达相关的氧化还原失衡。EGFP-GR₅₀在细胞质和细胞核中的双重分布提示poly-GR可能通过多种途径影响NRF2调控，但具体机制尚需进一步研究。Sigma-1R调节后NRF2和HO1的恢复表明这一受损的抗氧化反应可被干预。研究还讨论了DPR重复长度和序列差异对毒性影响的复杂性，指出EGFP-PR₄₂和EGFP-GR₅₀在序列和重复长度上的差异限制了将观察到的反应单纯归因于DPR类型。Sigma-1R过表达和药理学激活均能有效恢复NRF2/HO1信号并减轻氧化应激，其中氟伏沙明作为FDA批准的药物具有潜在的转化价值。体内实验中SigmaR1敲除小鼠生存期缩短和神经元数量减少提供了Sigma-1R神经保护作用的证据。研究也承认了若干局限性，包括未使用iPSC来源运动神经元、AAV急性过表达模型不能完全反映慢性疾病进程、早期 postnatal 致死限制了行为学分析等。

研究结论指出，Sigma-1R过表达或药理学激活可恢复NRF2/HO1信号、减轻ROS积累并降低poly-GR诱导应激下的神经元易感性。NRF2药理学抑制可减弱Sigma-1R激动剂介导的HO1恢复，为Sigma-1R激活下游的NRF2依赖性抗氧化机制提供了额外证据。这些发现支持Sigma-1R作为poly-GR相关氧化还原功能障碍和神经退行性变的调节因子，并支持进一步研究Sigma-1R信号通路作为C9orf72相关ALS潜在治疗途径的可行性。