《Frontiers in Molecular Biosciences》：When absence becomes functional: lysine deserts in protein regulation and evolution
摘要：赖氨酸荒漠（lysine deserts）——即蛋白质中不含赖氨酸残基的连续延伸区域——广泛存在于各类蛋白质组中，然而其定义、进化起源及生物学意义仍未完全阐明。本综述考察了局部赖氨酸缺失与蛋白质调控之间关联的证据，重点关注泛素（ubiquitin）依赖性及蛋白酶体（proteasome）依赖性通路。对毒素催化亚基及泛素-蛋白酶体系统内源组分的研究表明，在选定位置引入赖氨酸可改变泛素化、蛋白质周转或功能。这些发现支持一种情境依赖性模型，即赖氨酸荒漠可在特定结构与酶学环境中限制泛素受体位点的可用性，而非普遍保护整个蛋白质免于修饰或降解。本文讨论了赖氨酸位置、溶剂可及性、E3连接酶几何结构及蛋白质构象如何决定引入赖氨酸的后果，以及N端或非赖氨酸泛素化以及不依赖泛素的蛋白水解如何绕过赖氨酸缺失。本文还探讨了所选放线菌（Actinobacteria）及分枝杆菌噬菌体（Mycobacterium phages）中赖氨酸荒漠富集的报道，提出了一个可检验的Pup-蛋白酶体适应假说。最后，本文讨论了泛素化之外的可能功能，以及区分选择性赖氨酸缺失与组成性偏差或偶然因素所面临的方法学挑战。
1 引言
赖氨酸贫乏的延伸区域存在于细菌和植物毒素、噬菌体蛋白及泛素系统的内源组分中，提示赖氨酸缺失可能保护蛋白质免受赖氨酸导向的泛素化或降解。在选定的实验系统中，在特定位置恢复赖氨酸可改变泛素化、蛋白质丰度或功能。然而，这些效应依赖于分子情境，本身并不能解释这些区域为何缺乏赖氨酸。如此广泛的赖氨酸缺失究竟有多不寻常？
回答这一问题需要考虑基因组组成、蛋白质架构及生态等因素如何塑造氨基酸使用。赖氨酸本身并不稀有：其在UniProtKB中约占残基的5%，在经审阅的Swiss-Prot子集中占5.8%，相当于每17–20个位置约有一个赖氨酸残基。在一个刻意简化的模型中，假设残基独立采样且每个位置为赖氨酸的概率为5%，一条300残基序列不含赖氨酸的预期频率约为2 × 10?7。真实蛋白质表现出区域组成异质性及残基间依赖性，但这一简单计算说明了为何在一条组成上典型的序列中广泛赖氨酸缺失值得更仔细的审视。
然而，即使统计上意外的缺失本身也不能证明自然选择偏好消除某种氨基酸。Zhao等人发现14.1%–23.4%的已注释全长蛋白质至少缺乏一种标准氨基酸。这些蛋白质通常短于各自蛋白质组的平均值，且氨基酸缺失与缺失残基的背景丰度呈负相关，提示许多情况可在无残基特异性选择的情况下产生。更具提示性的是，25对人类和小鼠直系同源物在两种物种中均缺乏赖氨酸——这是一项早期蛋白质组规模的观察，与某些蛋白质中赖氨酸缺失可能被进化维持的可能性一致。这些对比性观察促使我们提出一个定义，以区分统计上不令人惊讶的全蛋白缺失与本文所关注的异常长赖氨酸缺失区域。
这些异常长区域的潜在功能意义源于对毒素和E3泛素连接酶的研究，其中赖氨酸缺失被实验性地与蛋白质稳定性相关联。Sharma等人随后引入"赖氨酸荒漠"一词，用于描述酵母泛素连接酶Slx5中一段398残基的赖氨酸-free区域。此后该术语被更广泛地应用，但不存在通用阈值。Kampmeyer等人识别了每种蛋白质最长的连续赖氨酸-free片段，并按绝对长度对蛋白质进行排序而不施加通用截断值，而Szulc等人则使用两个操作性标准进行蛋白质组规模筛选：连续赖氨酸-free区域至少150个残基，或跨越序列至少50%。在本综述中，赖氨酸荒漠指蛋白质序列中不含赖氨酸残基的延伸连续区域（图1A）。该术语本身描述一种序列模式，本身并不意味着赖氨酸缺失源于自然选择。
绝对长度和比例序列覆盖度捕捉了赖氨酸缺失的不同形式。占据多结构域蛋白质小部分的长赖氨酸-free区域可能局限于一个结构域或 intrinsically disordered region。相比之下，跨越大部分紧凑蛋白质的较短荒漠表明潜在赖氨酸受体位点在整个序列中几乎都稀缺。然而，这两种度量均未揭示荒漠在三维空间中如何呈现。折叠后，序列定义的荒漠可能形成暴露的赖氨酸-free表面、保持埋藏状态或分布在多个独立表面上。因此其生化意义取决于结构可及性及相对于相关分子机器的几何关系。因此，单一截断值不太可能适用于所有蛋白质和蛋白质组。在可能的情况下，研究应同时报告绝对长度和比例覆盖度，描述相关结构域、无序性和结构情境，并确定其结论对替代阈值是否稳健。
无论使用何种操作性定义，赖氨酸缺失都可能产生重要的生化后果。赖氨酸将带正电荷的侧链与作为泛素和泛素样修饰物受体的ε-氨基结合，同时也是甲基化和多种酰化修饰的位点。从蛋白质区域中去除赖氨酸因此可改变静电学和分子间相互作用，同时移除多条共价调控途径。泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）为这种缺失可能影响蛋白质命运提供了最清晰的机制情境。泛素通常通过E1–E2–E3酶级联转移，最常通过异肽键连接到底物赖氨酸上。根据情境不同，泛素化可调控运输、信号传导、DNA修复等过程或促进蛋白酶体降解。
赖氨酸可用性可决定是否存在常规泛素受体，但并非每次泛素化事件都导致蛋白酶体降解。有效的降解通常需要可及受体位于有利的E3–底物几何关系内、合适的泛素信号，以及26S蛋白酶体可接合以启动底物解折叠的非结构化起始片段。因此，蛋白质可能在不消除每个赖氨酸的情况下获得局部保护。去除表面暴露且位置有利于从相关E3接受泛素的赖氨酸，可减少该区域内有效的泛素化，形成局部分子绝缘（图1B）。这种保护并非绝对的，因为泛素有时可连接到N端或非赖氨酸侧链，蛋白质也可经历不依赖泛素化的蛋白酶体降解。
在本综述中，局部分子绝缘指赖氨酸荒漠保护特定蛋白质区域免受泛素化的假说。该模型预测，在赖氨酸荒漠中引入可及赖氨酸应导致新引入残基被泛素化，前提是相关泛素转移机器可及。该修饰随后是否影响蛋白质稳定性或功能是另一个问题。相反，未能检测到泛素化仅在已知相关酶存在且有活性时才反对分子绝缘模型；否则，阴性结果仍不具结论性。
对AB毒素和内源E3连接酶San1及Slx5–Slx8的研究为评估该模型提供了起点。本文考察这些基础实验及后续对其他UPS组分的研究如何支持或限定赖氨酸导向泛素化的局部保护。随后讨论替代泛素化和蛋白水解途径如何绕过赖氨酸缺失，所选放线菌及其噬菌体中赖氨酸荒漠富集是否支持Pup-蛋白酶体适应假说，以及哪些实验限制约束了机制和进化解释。
2 恢复赖氨酸在毒素中产生蛋白酶体关联的脆弱性
赖氨酸稀缺与蛋白水解抗性之间的早期联系源于对通过内质网（endoplasmic reticulum, ER）运输并被认为利用ER相关降解（ER-associated degradation, ERAD）进入胞质的毒素的研究。London和Luongo发现多种AB毒素的催化A结构域中Arg/Lys使用偏倚远强于其受体结合B结构域。这种偏倚的方向各不相同：单个催化结构域几乎专一性地使用精氨酸或赖氨酸，而鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）基因含量本身不能充分解释结构域特异性模式。Hazes和Read随后为赖氨酸贫乏亚群提供了机制解释。聚焦于包括蓖麻毒素、霍乱毒素和百日咳毒素在内的ER导向毒素，他们提出这些蛋白质通过接合ERAD组分进入胞质。这条途径给毒素带来了潜在问题：进入该途径的蛋白质可能被泛素化并被胞质蛋白酶体降解，而毒素必须持续足够长时间以发挥作用。Hazes和Read提出，催化A链异常低的赖氨酸含量（这一模式现以赖氨酸荒漠术语讨论）减少了宿主介导泛素化的机会，可能允许一些脱位的毒素分子逃避免疫蛋白酶体破坏。
靶向诱变随后检验了这一降解-规避假说，并表明赖氨酸引入可在ER运输毒素亚基中产生蛋白酶体关联的脆弱性，尽管各研究间机制证据的完整性有所不同。蓖麻毒素A链（ricin A chain, RTA）仅含两个天然赖氨酸。将两者均替换为精氨酸并未增加毒素效力，提示这些赖氨酸通常不作为降解关联泛素化的有效受体。相比之下，引入四个额外赖氨酸将细胞毒性降低了两个数量级，而未可检测地损害催化活性、结构或内在稳定性。蛋白酶体抑制将赖氨酸丰富的RTA变体的效力恢复到接近野生型水平，缺陷的泛素激活也减轻了这种细胞毒性损失。在相思豆毒素A链中引入四个额外赖氨酸同样导致蛋白酶体敏感的细胞毒性损失。这些发现通过显示赖氨酸引入在不损害催化活性或稳定性的情况下产生了蛋白酶体敏感的毒素活性损失，为赖氨酸稀缺的保护作用提供了间接支持。
霍乱毒素A1（cholera toxin A1, CT A1）的实验表明，逆转位和细胞活性既不需要内部赖氨酸也不需要游离N端α-氨基，这是通过使用化学封闭N端的赖氨酸-free变体证明的。在选定位置引入赖氨酸引起中等程度的、蛋白酶体敏感的毒素功能减弱，而无折叠改变的证据。一项后续研究考察了非结构化N端延伸如何改变CT A1逆转位后的命运。该延伸损害了CT A1的体外重折叠并促进其在胞质中的快速蛋白酶体降解。将两个天然赖氨酸替换为精氨酸使延伸的A1链无需蛋白酶体抑制即可在胞质中积累。然而，蛋白酶体抑制仍进一步增加了N端延伸、赖氨酸-free构建体的活性，除非其N端α-氨基被化学封闭，提示N端可能提供替代泛素受体位点。尽管未直接检测到CT A1泛素化，这些发现将天然赖氨酸和游离N端α-氨基均牵连到N端延伸所创造的蛋白酶体易感性中。CT A1逆转位也受去泛素化酶YOD1活性影响，该酶被提议作用于泛素化的ERAD组分而非CT A1本身。总之，CT A1的发现支持一种情境依赖的分子绝缘形式，其中赖氨酸稀缺限制直接的蛋白酶体易感性，而N端情境、蛋白质折叠和泛素调控的ERAD机器继续塑造毒素命运。
百日咳毒素天然赖氨酸-free的S1催化亚基（pertussis toxin S1, PT S1）观察到类似的位置依赖模式。所测试的Arg→Lys变体在体外保留野生型样酶活性，但细胞活性降低，效应大小取决于引入赖氨酸的位置和数量。匹配的Arg→Ala对照保留接近野生型的细胞活性，支持赖氨酸引入而非精氨酸丢失的效应。蛋白酶体抑制显著增加了含多个引入赖氨酸变体的细胞活性，其中三位置变体效应最大。这些结果因此通过将引入赖氨酸的位置和数量与蛋白酶体敏感的细胞活性损失相关联而不损害酶功能，间接支持赖氨酸稀缺的保护作用。
总体而言，这些毒素研究表明抗降解保护依赖于局部分子情境而非仅赖氨酸数量。赖氨酸稀缺因此可能局部限制赖氨酸导向的泛素化，而不赋予内在的、蛋白质-wide的抗降解能力。然而，任何毒素变体的泛素化均未被证明，所涉及的赖氨酸和提议的N端也未被直接鉴定为泛素受体。对于RTA、相思豆毒素A链和PT S1，降解是从蛋白酶体敏感的毒素活性变化推断的，而非直接测量。更普遍地，赖氨酸缺失不能防止不依赖泛素的蛋白水解。分离的CT A1和PT S1在生理温度附近热不稳定，纯化的20S蛋白酶体在无泛素结合机器的情况下体外降解了去折叠亚基。然而，蛋白酶体接合不必是破坏性的：天然的赖氨酸贫乏RTA在体外被哺乳动物26S蛋白酶体低效降解，而分离的19S调节颗粒限制了RTA聚集并促进其催化活性恢复。表1将这些毒素发现与其他赖氨酸恢复研究并列，总结了其实验方法、结果、机制证据和主要局限性。在所考察的毒素系统中，赖氨酸引入因此最好被理解为创造一种情境依赖的、位置和折叠敏感的蛋白质稳态脆弱性。
3 赖氨酸恢复揭示泛素系统内情境依赖的分子绝缘
毒素研究提出了一个更广泛的问题：泛素系统的内源组分当其自身表面反复靠近泛素转移机器时，是否面临类似的分子约束？E3泛素连接酶、泛素受体、底物适配器和蛋白酶体穿梭因子与激活的泛素、E2酶、底物或蛋白酶体相互作用，可能使选定区域暴露于意外泛素化。局部赖氨酸缺失是否减少此类修饰同时保留蛋白质其他部分的泛素依赖调控，以及这是否为此目的而进化，仍是一个开放问题。
赖氨酸缺失可保护内源蛋白的首批实验证明之一来自酵母核质量控制E3连接酶San1。San1包含一个中央Really Interesting New Gene（RING）结构域——招募泛素负载E2酶并促进泛素转移的催化模块——两侧为柔性底物结合区域。这些区域不含赖氨酸，而蛋白质的少数赖氨酸集中在RING结构域内或其附近。在赖氨酸缺失区域中测试的17个位置中的任何一个引入单个赖氨酸均导致快速降解，而匹配的精氨酸或天冬酰胺替换则不然。使用RING失活变体和有或无内源San1的细胞，作者区分了三种主要降解途径：11个变体主要通过San1依赖的顺式自泛素化降解，三个主要通过反式自泛素化降解，三个主要通过San1非依赖途径。然而，RING失活仍增加了所有测试变体的稳态丰度，表明顺式自泛素化在不同程度上促进了它们的降解。在两个代表性变体中，将所有天然San1赖氨酸替换为精氨酸使引入残基成为唯一赖氨酸；两个构建体均被泛素化并经历RING依赖降解。这种唯一赖氨酸设计强烈暗示引入残基为泛素受体，尽管附着位点未被直接定位且研究未测试降解是否被蛋白酶体抑制阻断。无序、赖氨酸缺失区域的组织在不同真菌直系同源物中保守，且赖氨酸引入在酿酒酵母中表达时使粟酒裂殖酵母直系同源物不稳定。San1因此为分子绝缘提供了强有力的机制支持，其中柔性底物结合区域内的赖氨酸缺失限制了连接酶自身泛素转移活性的自靶向降解。
酵母SUMO靶向连接酶Slx5–Slx8提供了独立遗传和生化证据，表明赖氨酸荒漠可限制自靶向降解。一个合成致死筛选恢复了两个独立抑制等位基因，每个都在Slx5的398残基赖氨酸荒漠中引入单个赖氨酸。第三个工程化赖氨酸替换产生类似抑制表型，而相应精氨酸替换则不然。两个筛选来源变体为亚效等位基因，其功能损害程度因遗传背景而异。含有任一变体的纯化Slx5–Slx8复合物在体外显示Slx5自泛素化增加，暗示引入赖氨酸为受体，尽管直接缀合到这些残基和细胞中Slx5自泛素化增强未被直接证明。两个变体均显示显著降低的细胞丰度，蛋白酶体抑制后增加；Slx5 RING结构域失活将其丰度恢复到接近野生型水平。RING失活变体与野生型Slx5共表达时保持稳定，表明它们未被有效反式靶向，支持主要为顺式自泛素化后蛋白酶体降解。野生型Slx5丰度在蛋白酶体抑制或RING失活后也增加，表明天然赖氨酸荒漠限制而非消除自靶向降解。赖氨酸荒漠也促进Slx5–Slx8功能：删除其略超过一半产生表达良好的蛋白质，保留部分功能但比野生型Slx5更不有效地互补生长缺陷。序列比较鉴定出延伸赖氨酸荒漠主要存在于大型真菌Slx5同源物中；较小的真菌同源物和哺乳动物RNF4缺乏等效长结构域，尽管一些含有功能意义不确定的比例上广泛的赖氨酸-free区域。总之，Slx5发现支持一种模型，即局部赖氨酸缺失限制功能重要区域内过度的顺式自泛素化和蛋白酶体损失。
酵母ERAD连接酶Hrd1提供了局部受体缺失可能保护内源E3连接酶免受有害自泛素化的进一步例子。深度突变扫描鉴定出两个预测的无序胞质区域，它们耐受许多氨基酸替换但选择性地不耐受赖氨酸和半胱氨酸替换。在两个区域中选定位置引入赖氨酸或半胱氨酸通常降低Hrd1丰度并损害其降解ERAD底物的能力。催化失活阻止了所测试变体丰度的降低，支持其去稳定化源于Hrd1自泛素化的解释。在体外自泛素化后，质谱直接鉴定一个引入赖氨酸为泛素受体，尽管受体位点鉴定在单个重复中执行。含每个缺失区域一个引入赖氨酸的双变体在重构系统中仍保留与野生型Hrd1相当的自泛素化、底物泛素化和逆转位活性。这一发现反对赖氨酸引入这些区域必然直接损害Hrd1活性，而支持降低细胞丰度作为ERAD缺陷的主要解释。然而，周转动力学和蛋白酶体依赖性未被测试，重构测定含Hrd1而无其他可与其关联的蛋白质。预测的无序胞质区域中赖氨酸和半胱氨酸缺失也在从真菌到哺乳动物的Hrd1同源物中被鉴定，尽管其长度和位置各异且此重复模式的功能意义未被测试。Hrd1因此将分子绝缘模型扩展到仅赖氨酸缺失之外，提示局部排除赖氨酸和半胱氨酸可通过限制功能重要无序区域内自泛素化关联损失来保持连接酶丰度。
后续基于序列的普查和靶向赖氨酸恢复实验考察了类似保护是否发生在其他UPS组分中。San1启发的生物信息学分析在额外酵母和人类E3连接酶及BAG6中鉴定出赖氨酸贫乏、通常无序的区域，从而扩展了候选例子集而未实验测试这些区域是否共享保护机制。后续蛋白质组规模筛选在数百个人类蛋白质中鉴定出长赖氨酸-free区域，并选择六个UPS相关蛋白进行实验分析：RAD23A、UBQLN1、UBQLN2、BAG6、RNF115和PSMF1。Arg→Lys变体在六个蛋白中的五个中显示增加的蛋白质水平泛素化，PSMF1为例外；为RAD23A、UBQLN1和BAG6测试的匹配Arg→Gln对照未重现此增加。在RAD23A、UBQLN1和BAG6中测试单个Arg→Lys替换显示一些位置增加蛋白质水平泛素化而其他无可检测效应。在单个质谱实验中，引入赖氨酸在RAD23A和UBQLN1中均被直接鉴定为泛素受体位点。E6AP和RNF126过表达（而非其催化失活变体）分别增强赖氨酸恢复的RAD23A和BAG6泛素化，证明这些E3可促进修饰而不建立其在内源条件下的必要性或排他性。为测试增加泛素化是否导致蛋白酶体降解，作者检查了稳定细胞系中的蛋白质丰度。UBQLN1和BAG6 Arg→Lys变体丰度较低且被蛋白酶体抑制稳定化，而RAD23A丰度基本不受影响。这一对比结果促使作者检查赖氨酸恢复是否反而影响RAD23A功能。Arg→Lys变体互补缺乏内源RAD23A直系同源物的粟酒裂殖酵母细胞UV敏感表型的效率低于野生型RAD23A。RAD23A因此提供直接证据表明恢复的赖氨酸可成为泛素受体，并伴随相关功能表型，但不支持抗降解保护。引入赖氨酸的泛素化是否导致互补缺陷仍未解决，因为蛋白质折叠、结构或定位的间接效应无法排除。对于PSMF1，仅测试了一个Arg→Lys替换，且未检查下游结果，使其赖氨酸荒漠与局部保护的相关性仍未解决。总体而言，该研究支持赖氨酸缺失在E3连接酶之外的保护作用，效应取决于所检查的蛋白质和位置。
一项后续研究更详细地检查了人类UBQLN2，询问赖氨酸的区域可用性如何影响其泛素化、周转和亚细胞定位。赖氨酸缺失区域中的多位置Arg→Lys变体显示比野生型UBQLN2更大的蛋白质水平泛素化，尽管引入赖氨酸未被定位为泛素受体。该变体也显著不丰富，但其水平在蛋白酶体抑制和E6AP缺陷细胞中增加，与E6AP依赖的蛋白酶体降解一致。因为UBQLN2通常形成胞质斑点，作者还检查了赖氨酸引入是否改变此定位模式。Arg→Lys变体显示显著减少的斑点形成，在E6AP缺陷细胞中大部分恢复，尽管斑点更小且每细胞更少。然而，此表型无法与蛋白质丰度变化分离，因为E6AP破坏也恢复了该变体的水平，而将精氨酸替换为赖氨酸可能本身降低UBQLN2相分离倾向。匹配的Arg→Gln变体进一步使此解释复杂化，因为与野生型UBQLN2相比，其显示减少的泛素化、显得更丰富并显示更广泛的胞质分布，表明该区域内的替换可通过创建泛素受体位点以外的机制影响UBQLN2。相比之下，过表达野生型UBQLN2的质谱鉴定其N端泛素样结构域内六个赖氨酸为泛素受体，而野生型蛋白的蛋白质水平泛素化不受E6AP破坏影响。总之，这些结果与UBQLN2赖氨酸荒漠的保护作用一致：引入此区域的赖氨酸使UBQLN2对E6AP依赖的蛋白酶体降解敏感，而野生型蛋白质水平泛素化在测试条件下不受E6AP破坏影响。
赖氨酸荒漠也已在真核蛋白质组和模块化cullin-RING连接酶（cullin-RING ligases, CRLs）中被检查，CRLs是通过neddylation——泛素样蛋白NEDD8共价附着到cullin支架——激活的多蛋白E3复合物。使用绝对（≥150残基）和相对（≥序列50%）赖氨酸荒漠定义，Szulc及其同事发现相同的广泛趋势：赖氨酸荒漠的蛋白质组规模流行率在哺乳动物中大于真菌分类群（图2A），且仅计数直系同源物间保守的赖氨酸荒漠的分析产生相同模式。该研究还定义了赖氨酸簇为跨越不超过蛋白质序列20%且含至少等于蛋白质总赖氨酸数向下取整80%的整数个赖氨酸残基的区域，仅考虑至少含两个赖氨酸的蛋白质（图2B）。在五个选定真核蛋白质组（酵母、线虫、果蝇、小鼠和人类）中，31%–49%满足相对赖氨酸荒漠标准的蛋白质也满足赖氨酸簇定义（图2C）。因此，延伸赖氨酸-free区域可与大多数剩余赖氨酸集中在短序列片段内共存，提示某些蛋白质中赖氨酸可用性被区域性地划分。保守的真核蛋白质稳态因子在显示此架构的蛋白质中突出。UBQLN1和UBQLN2（上文讨论）提供了显著例子，其中长赖氨酸荒漠与剩余赖氨酸集中在N端结构域内共存。该分析也扩展到细菌和噬菌体蛋白质组，其中所选放线菌和分枝杆菌噬菌体中报告了更高的赖氨酸荒漠蛋白质流行率，如第5节所讨论。
除了这些生物信息学分析，同一研究检查了两个人类非催化CRL底物受体VHL和SOCS1，以测试赖氨酸缺失是否可提供分子绝缘。在VHL中，赖氨酸荒漠占据哺乳动物蛋白比其线虫和果蝇直系同源物更大的比例，而无相应蛋白质长度增加；在几个比对位置，较远直系同源物中的赖氨酸对应于人类VHL中的精氨酸。其三个剩余赖氨酸在分离蛋白中暴露，尽管CRL组装可能限制其中一或两个的可及性。两个携带荒漠内不同Arg→Lys替换集的VHL变体显示降低的稳定性，且此效应被neddylation、E1活性或蛋白酶体抑制减弱。作者随后询问天然VHL中保留的少数赖氨酸如何影响其泛素化和周转。为此，他们比较了野生型VHL与其赖氨酸-free变体。两者显示相似的基线周转并在蛋白酶体抑制后积累。E1抑制也稳定化两种形式，而neddylation抑制仅中度稳定化野生型VHL。NanoBRET（作者用作活细胞泛素化代理）检测到野生型和赖氨酸-free VHL的相似泛素邻近信号，E1抑制降低两种形式的信号。Neddylation抑制产生不太一致的降低，仅在一个野生型VHL配置中达到统计显著性。因为NanoBRET测量邻近而非共价缀合，这些信号未建立VHL的非赖氨酸泛素化或鉴定相关受体位点或E3连接酶。为测试泛素化的VHL结合底物是否促进信号，作者药理学地阻断其主要底物结合位点。这未降低NanoBRET信号，反对通过该位点结合的底物的主要贡献。SOCS1在脊椎动物间显示更显著的赖氨酸含量差异和对赖氨酸恢复的对比反应。斑马鱼Socs1a含15个赖氨酸，而小鼠和人类SOCS1仅含一个，许多相应哺乳动物位置为精氨酸。人类SOCS1的唯一赖氨酸被预测埋藏，三个携带不同Arg→Lys替换集的变体显示无可检测的稳定性变化。野生型和赖氨酸-free SOCS1显示相似基线周转并在蛋白酶体抑制后积累，但两种形式均不被E1活性或neddylation抑制稳定化。NanoBRET检测到野生型和赖氨酸-free SOCS1的相似泛素邻近信号，E1抑制降低两种形式的信号，而neddylation抑制无显著效应；与VHL不同，无可用的类似底物结合抑制剂来评估泛素化SOCS1结合蛋白的贡献。配对分析因此产生明确分歧：两种受体的野生型和赖氨酸-free形式均显示蛋白酶体敏感周转，但赖氨酸恢复去稳定化VHL而不显著影响SOCS1稳定性。此外，E1抑制稳定化VHL的两种形式但SOCS1的两种形式均不，尽管两种受体的赖氨酸-free形式均保留E1依赖的泛素邻近信号。VHL发现为局部赖氨酸缺失的保护作用提供间接支持：引入赖氨酸通过neddylation依赖的泛素途径（可能涉及CRL）使蛋白质对降解敏感，尽管引入赖氨酸变体的泛素化增加或引入残基的修饰均未被直接证明。对于SOCS1，赖氨酸引入无可检测的稳定性效应，在测试条件下为基于稳定性的保护提供不支持。其蛋白酶体敏感但E1不敏感的周转与不依赖泛素的降解相容，而NanoBRET信号可反映非降解性泛素化在非赖氨酸位点或与泛素化伙伴的邻近。
为鉴定在蛋白酶体能力降低时维持蛋白质降解的因素，Yanagi及其同事在秀丽隐杆线虫skn-1a突变体中进行了无偏遗传筛选。选择此背景是因为SKN-1A（哺乳动物Nrf1的线虫对应物）是促进蛋白酶体生物发生的转录因子，其缺失降低蛋白酶体丰度。筛选鉴定了增加泛素融合降解报告基因积累的eel-1突变。EEL-1（人类HUWE1和酵母Tom1的线虫直系同源物）是 homologous to the E6-AP carboxyl terminus（HECT）型E3连接酶，具有涵盖酸性无序区域和三个泛素结合基序的保守赖氨酸荒漠。几个筛选来源突变在或邻近这些区域引入赖氨酸，促使作者研究赖氨酸缺失如何促进EEL-1功能。其中两个赖氨酸替换在skn-1a突变体背景中单独测试。每个替换增加报告基因积累，而匹配的丙氨酸或精氨酸替换则不然。同样，在赖氨酸荒漠内任意选定位置引入赖氨酸损害报告基因降解。这些观察表明表型特异性地与赖氨酸引入而非序列扰动本身相关。内源EEL-1蛋白在一个赖氨酸变体中不可检测，在另一个中勉强可检测。HECT结构域活性位点失活显著增加野生型EEL-1和一个测试赖氨酸变体的丰度，提示自泛素化调节EEL-1丰度且引入赖氨酸增强此过程。然而，EEL-1泛素化或引入赖氨酸的修饰均未被直接证明，EEL-1丰度降低的蛋白酶体依赖性未被测试。作者还检查了skn-1a突变体背景中赖氨酸引入的生理后果，发现效应取决于赖氨酸位置和动物年龄。一个替换引起外阴破裂的中等增加，另一个产生延迟表型，第三个在成年第二天引起与eel-1 null突变体相当的破裂。最后，作者将结合标签插入EEL-1以将荧光底物拴系到蛋白质。在标签旁添加单个赖氨酸使更多底物完整，提示降解受损。在单独拯救实验中，将蛋白质结合到标签减少泛素融合降解报告基因积累和外阴破裂，提示屏蔽引入赖氨酸可减轻其有害效应。这些发现通过将赖氨酸引入与连接酶依赖的EEL-1丰度损失和功能损害相关联，为分子绝缘提供间接支持，而未直接证明EEL-1泛素化。
总体而言，这些研究支持赖氨酸缺失的局部而非蛋白质-wide效应。赖氨酸荒漠可减少特定区域内有效泛素受体位点的可用性，而不阻止蛋白质本身的泛素化或降解。在上述系统中，在荒漠区域内引入赖氨酸引起连接酶依赖的自去稳定化、蛋白酶体敏感的丰度损失、增加的蛋白质水平泛素化、功能损害或无检测效应，取决于所检查的蛋白质、途径和位置（图3）。分子绝缘的理想测试应显示引入的、适当定位的赖氨酸被相关泛素转移机器直接修饰，且此修饰引起途径依赖的蛋白质丰度或功能变化。San1和Slx5–Slx8为自靶向降解保护提供特别强的证据：San1通过广泛位置测试和唯一赖氨酸构建体，Slx5–Slx8通过RING和蛋白酶体依赖的丰度效应。互补位点水平证据来自Hrd1、RAD23A和UBQLN1，其中引入赖氨酸被直接定位为泛素受体。EEL-1进一步将功能证据扩展到多细胞生物中的生理表型。然而，SOCS1显示赖氨酸可用性并非总是蛋白质稳定性的限速因素，而PSMF1赖氨酸荒漠保护作用的证据仍不确定，因为仅测试了一个赖氨酸位置且未检查下游结果。本文讨论的研究也总结于表1。
在不同程度上，这些扰动研究确定了赖氨酸缺失在特定系统中能做什么，但未确定任何给定赖氨酸荒漠为何进化。分子绝缘因此应被视为一种情境依赖模型，可通过受控赖氨酸恢复实验测试，而非每个赖氨酸荒漠的内在属性。
4 替代受体位点和蛋白水解途径可绕过赖氨酸缺失
泛素化和降解可在赖氨酸丢失后通过多种机制持续存在。即使赖氨酸ε-氨基受体缺失，泛素也可能附着到游离N端α-氨基或半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸侧链。蛋白酶体降解也可在无底物泛素化的情况下进行。赖氨酸缺失因此移除了一大类泛素受体位点，而不一定阻止泛素依赖调控或蛋白酶体降解。
MyoD的早期实验证明其天然赖氨酸对泛素依赖降解并非必需。将所有赖氨酸替换为精氨酸约使其半衰期加倍，但未消除多聚泛素化或蛋白酶体依赖降解。相比之下，选择性阻断游离N端α-氨基在体外阻止MyoD泛素化并稳定化蛋白质，而添加N端Myc标签在体外和细胞中均稳定化它。尽管赖氨酸-free MyoD构建体是工程化的而非天然赖氨酸荒漠，这些实验提供了游离N端可在无赖氨酸情况下支持泛素依赖蛋白酶体降解的证据。
天然赖氨酸-free蛋白的研究随后提供了N端泛素化的进一步证据。内源p16INK4a在稀疏细胞中被泛素化并经历蛋白酶体敏感降解，而HPV-58 E7在无细胞系统中被多聚泛素化并在转染细胞中以蛋白酶体依赖方式降解。质谱直接鉴定E7中的N端泛素连接，而p16INK4a中的受体位点未被定位。类似地，将Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白1（latent membrane protein 1, LMP1）的唯一赖氨酸替换为精氨酸产生赖氨酸-free变体，其保持泛素化并经历E1和蛋白酶体依赖降解。N端Myc标签稳定化野生型和赖氨酸-free LMP1，而删除其前12或24个残基稳定化赖氨酸-free变体。这些发现将N端区域牵连到LMP1降解靶向中，尽管泛素附着到N端未被直接证明。Kuo及其同事同样发现天然赖氨酸-free的人类p14ARF及其小鼠直系同源物p19Arf的赖氨酸-free变体被多聚泛素化并被E1失活稳定化；p19Arf周转也是蛋白酶体敏感的。Factor Xa切割将多聚泛素定位到p19Arf的N端片段，而有利于N端乙酰化的变体显示减少的多聚泛素化和较慢周转。同样，这些结果支持泛素附着到游离N端，尽管精确连接未被直接定位。
更近期，El Motiam及其同事发现p14ARF的N端区域也支持SUMO修饰。SUMO2修饰的p14ARF在体外和细胞中被检测到，对于外源表达和内源p14ARF均如此。化学阻断游离N端α-氨基在体外阻止可检测的SUMO化，而促进N端乙酰化或删除前35个残基在细胞中消除该修饰。SUMO2过表达增加p14ARF丰度，而消耗SUMO缀合酶UBC9或抑制SUMO E1缩短其半衰期。抑制泛素激活或neddylation也增加p14ARF SUMO化。总之，这些发现提示途径间的串扰和可能的竞争，尽管SUMO受体位点和N端α-氨基的直接竞争均未被证明。
对于泛素化，E2酶UBE2W在赖氨酸受体不可用时提供了明确的酶学途径。Scaglione及其同事表明UBE2W在体外优先单泛素化蛋白质N端。使用诱导型UBE2W过表达系统，Davies及其同事鉴定了大量推定细胞底物。N端泛素化信号在蛋白酶体抑制后通常保持不变，与在测试条件下此修饰通常不作为蛋白酶体降解信号一致。在鉴定底物中有去泛素化酶UCHL1和UCHL5。UBE2W在体外单泛素化两种蛋白的赖氨酸-free形式，而N端泛素模拟物抑制UCHL1但增强UCHL5催化活性。因此，游离N端氨基在赖氨酸缺失时提供替代泛素受体，但其修饰后果取决于底物。
除N端外，泛素也可转移到半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸侧链。卡波西肉瘤相关疱疹病毒编码的E3泛素连接酶MIR1促进主要组织相容性复合物I类变体的主要半胱氨酸依赖泛素化和溶酶体降解，该变体缺乏胞质尾赖氨酸。NY-ESO-1癌/睾丸抗原天然含单个赖氨酸，但替换它不阻止泛素化或蛋白酶体依赖加工，化学敏感性暗示丝氨酸/苏氨酸氧酯连接。因此，赖氨酸受体丢失不必阻止泛素化，因为游离N端α-氨基和亲核侧链均可提供替代附着位点。然而，这些途径在含天然赖氨酸荒漠蛋白质中的流行率和生理重要性仍不清楚。
5 放线菌及其噬菌体中赖氨酸荒漠富集提出可检验的Pup-蛋白酶体适应假说
赖氨酸依赖的蛋白水解标记也发生在真核泛素系统之外。许多放线菌拥有Pup-蛋白酶体系统（Pup-proteasome system, PPS），其功能上类似于UPS但化学上不同。小型的、内在无序的原核泛素样蛋白（prokaryotic ubiquitin-like protein, Pup）通过其C端谷氨酸被PafA连接酶缀合到底物赖氨酸的ε-氨基上。Pup标记的底物随后可被Mpa/ARC ATPase接合并易位到20S蛋白酶体中。因为pupylation不使用E1–E2–E3级联，PPS代表一个独立进化的系统，其中赖氨酸可用性可能影响蛋白水解标签的可及性。
一项系统分析使用两种赖氨酸荒漠定义调查了超过8,000个细菌参考蛋白质组：绝对定义要求连续赖氨酸-free区域≥150残基，相对定义要求此类区域跨越蛋白质序列≥50%。在两种标准下，放线菌显示赖氨酸荒漠蛋白质的最高平均流行率；使用相对定义的结果示于图4A。在所选放线菌中，
