巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）可扩散信号促进水稻生长并诱导根系独特基因表达变化

《Frontiers in Plant Science》：Diffusible signals from Azospirillum brasilense promote rice growth and induce distinct gene expression changes in plant roots

植物与多种有益微生物形成联合，包括丛枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌、根瘤菌和植物促生细菌（plant growth-promoting bacteria，PGPB）。对豆科-根瘤菌共生（legume-rhizobia symbiosis，LRS）和AM共生的研究已表明，共生伙伴之间的分子交流对于启动这些互作至关重要。遗传和生化研究进一步鉴定了植物和微生物信号，以及调节这些互作的宿主遗传通路。然而，大多数关于植物-PGPB互作的研究集中在将PGPB直接施用于植物根系，导致这些互作背后的早期信号机制了解甚少。本研究中，研究人员报道，来自巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）的可扩散信号可在细菌与植物根系无直接接触的情况下促进水稻生长，处理后7天（7 days post-treatment，dpt）。利用RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq），研究人员在1 dpt鉴定了水稻根系中响应A. brasilense可扩散信号的2,516个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。研究人员鉴定了参与类黄酮合成、防御反应、受体活性、转录因子和激素通路的基因差异表达。对与A. brasilense接触或不接触的水稻根系进行比较转录组分析，揭示了共享和独特的基因表达模式。研究人员观察到，在无细菌接触时，某些防御反应基因（苯丙氨酸解氨酶，phenylalanine ammonia lyase，PAL；几丁质酶，chitinase；thionin）、转录因子（AP2/ERFs、MYBs、WRKYs和GRAS）以及激素相关（生长素，auxin；乙烯，ethylene）基因上调，但在细菌接触时这些基因下调或无差异表达。这种模式提示，这些基因的初始诱导随后抑制可能对建立与A. brasilense的互作至关重要。研究人员的转录组分析还提示，类黄酮可能在整个互作过程中都需要，而硝酸盐转运蛋白（nitrate transporters，NRTs）似乎参与后期阶段，并且可能需要植物根系与细菌接触。总体而言，研究人员的发现揭示，来自A. brasilense的可扩散信号可促进水稻生长并诱导植物根系中独特的基因表达变化。这些结果为水稻-A. brasilense互作的早期阶段提供了新见解，并强调了利用植物-PGPB信号机制在不利环境条件下提高作物生长的潜力。

植物可与根瘤菌、丛枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌和植物促生细菌（plant growth-promoting bacteria，PGPB）等有益微生物形成互利关系。在豆科-根瘤菌共生（legume-rhizobia symbiosis，LRS）和AM共生中，宿主根系与微生物在定殖前发生信号交换：植物分泌类黄酮等，微生物产生Nod因子（Nodulation factors）或Myc因子（Myc factors），宿主受体感知后引起形态、生理和转录组变化。然而，植物-PGPB互作研究多集中于将PGPB直接施用于根系，早期信号机制仍不清晰。已有研究表明植物根系分泌物可吸引PGPB，PGPB可释放植物激素、可扩散信号和挥发性有机化合物（volatile organic compounds，VOCs），且A. brasilense可扩散信号和VOCs在拟南芥中促生并调节生长素（auxin）和乙烯（ethylene）信号，但作物尤其是水稻中宿主生长和分子响应仍待研究。因此，研究人员假设A. brasilense可扩散信号能促进水稻生长并诱导根系转录变化，包括类黄酮合成、防御反应、受体、转录因子和激素相关基因。

研究人员利用适合水稻的物理分隔系统，使水稻根系与A. brasilense Sp245不接触但可接收可扩散信号。处理后7天（days post-treatment，dpt），可扩散信号显著增加水稻根质量；直接接触也显著增加根质量，且接触与可扩散处理的根质量无显著差异。总质量在可扩散处理中呈非显著增加趋势，在接触处理中显著增加。PCR检测确认可扩散处理下根系无细菌存在。RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）在1 dpt鉴定出2,516个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），其中1,766个上调、750个下调。比较接触和可扩散处理的转录组，发现835个共享DEGs、1,681个可扩散独有DEGs和1,833个接触独有DEGs。该研究结论是，A. brasilense可扩散信号足以促进水稻生长并诱导根系独特基因表达变化，为水稻-A. brasilense早期互作提供新见解，并提示可利用植物-PGPB信号机制在不利环境条件下提高作物生长。

关键技术方法（约250字）：研究人员以水稻品种Nipponbare和A. brasilense Sp245为材料，基于无菌植物琼脂添加低氮Fahraeus Medium（FM）培养。设接触水和接触A. brasilense、可扩散水和可扩散A. brasilense四组；可扩散处理用50微米滤纸条浸无菌水或A. brasilense悬液（10⁸ cells/ml）置于培养皿底部边缘，避免与根接触。表型在7 dpt采集，至少3次独立实验，平均每处理17株，用单因素ANOVA和Tukey’s HSD分析。PCR检测根系DNA中A. brasilense RecA和Sp245p10基因，水稻Cyclophilin为对照。RNA-seq取1 dpt根系，3个生物学重复，Illumina NovaSeq 6000平台150 bp双端测序，数据存于Sequence Read Archive（SRA）BioProject PRJNA1472649；用Trimmomatic、STAR和Cufflinks/cuffdiff分析，DEGs标准为错误发现率（false discovery rate，FDR）<0.05且倍数变化（fold change，FC）绝对值|FC|>1.5。RT-PCR验证7个DEGs。

研究结果：
来自Azospirillum brasilense的可扩散信号促进水稻生长。通过物理分隔表型实验，7 dpt可扩散信号显著增加根质量，接触也增加，且接触与可扩散根质量无显著差异；总质量可扩散仅趋势，接触显著。PCR确认可扩散处理无细菌接触。
分析水稻根系对A. brasilense可扩散信号的转录组。RNA-seq在1 dpt、三重复条件下，平均52 million reads，约97%通过质控，95%比对到水稻基因组；主成分分析（principal component analysis，PCA）显示处理分离。共鉴定2,516个DEGs，包括1,766上调、750下调。基因本体（Gene Ontology，GO）分析发现85个显著过代表条目：49个生物学过程、33个分子功能、3个细胞组分。数据挖掘显示类黄酮合成、防御反应、Lysin Motif（LysM）结构域蛋白和Lysin Motif受体样激酶（Lysin Motif Receptor-Like Kinase，LYK）、AP2/ERF、MYB、WRKY、GRAS转录因子及生长素和乙烯相关基因差异表达。
水稻根系与A. brasilense接触或不接触的比较转录组分析。与既往接触处理数据比较，835个DEGs共享，1,681个可扩散独有，1,833个接触独有。共享DEGs中49个共同上调，135个共同下调，155个可扩散下调/接触上调，496个可扩散上调/接触下调；约78%共享DEGs表达模式相反，59.4%属于可扩散上调/接触下调组。可扩散独有DEGs包括查尔酮合酶（chalcone synthase，CHS）、LYK受体、NSP2 GRAS转录因子及生长素响应和运输基因；接触独有DEGs包括柚皮素2-酮戊二酸3-双加氧酶（naringenin 2-oxoglutarate 3-dioxygenase）、病程相关（pathogenesis-related，PR）基因、LYK基因和硝酸盐转运蛋白（nitrate transporters，NRTs）。
基因表达验证。通过逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase-polymerase chain reaction，RT-PCR）验证7个随机选择的DEGs，包括Early Nodulin 93、GRAS家族转录因子、Ser/Thr受体样激酶、probable indole-3-acetic acid-amido synthetase、kinesin motor domain蛋白、histidine kinase和LysM结构域蛋白；结果与RNA-seq表达模式一致，至少3个生物学重复。

讨论部分总结：
讨论指出，LRS和AM共生已鉴定植物信号如类黄酮和独脚金内酯（strigolactones）及微生物Nod和Myc因子；而植物-PGPB互作因多涉及接触，早期信号不清。本研究证明A. brasilense可扩散信号足以促生并诱导水稻根系转录变化，且与接触处理有共享和独特模式。
类黄酮生物合成方面，可扩散处理中查尔酮合酶（chalcone synthase，CHS）和黄酮醇合酶（flavonol synthase，FLS）上调，柚皮素相关基因仅在接触处理上调；类黄酮可能在互作全程发挥作用。
防御反应方面，苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）、几丁质酶（chitinase）、植物硫素（thionin）在可扩散处理上调，而在接触时下调，类似LRS早期短暂诱导后抑制；部分PR基因在两种处理下均下调，提示植物调整免疫以促进互作。
受体方面，LysM结构域基因在可扩散处理上调，OsLYK7在可扩散处理上调而接触无差异；OsLYK1和OsLYK2/OsNFR5在接触处理差异表达而无接触时不表达。
转录因子方面，AP2/ERF、MYB、WRKY在可扩散处理上调而接触下调；GRAS包括NSP2在可扩散处理上调，接触下调或不表达，提示其可能参与早期互作。
激素相关基因和硝酸盐转运蛋白方面，生长素和乙烯相关基因在可扩散处理上调，接触时下调或不表达；NRTs在可扩散处理无差异表达，但在接触处理上调，提示硝酸盐转运可能参与后期并需要接触。

研究结论（翻译）：总结而言，研究人员报道，来自Azospirillum brasilense的可扩散信号可在细菌与植物根系无接触的情况下促进作物水稻生长。利用RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq），研究人员鉴定了无细菌接触时水稻根系的主要基因表达趋势，包括参与类黄酮生物合成、防御反应、受体、转录因子和激素的基因差异表达。研究人员还观察到一些病程相关（pathogenesis-related，PR）基因下调，以及硝酸盐转运蛋白（nitrate transporters，NRTs）无差异表达。此外，对A. brasilense可扩散处理和接触处理的比较转录组分析鉴定了共享和独特的基因表达趋势。例如，一些类黄酮生物合成基因在两种处理下均上调，提示类黄酮可能在整个互作过程中发挥作用。相反，一些PR基因在两种处理下均受抑制，提示植物调整其免疫以促进与A. brasilense的互作。有趣的是，某些防御反应基因（PAL、chitinase、thionin）、转录因子（AP2/ERFs、MYBs、WRKYs和GRAS）以及激素相关（auxin和ethylene）基因在可扩散处理中被诱导，但在与细菌接触的水稻根系中下调或无差异表达，暗示这些基因的初始诱导及随后抑制可能对建立与A. brasilense的互作至关重要。此外，硝酸盐转运蛋白在可扩散处理中无差异表达，但在与细菌接触的水稻根系中表达，提示其可能参与互作后期阶段。总体而言，研究人员的发现为两个伙伴发生任何接触之前，水稻根系与A. brasilense互作早期阶段的基因表达趋势提供了新见解。未来研究可集中于表征其他时间点的转录组反应、定义介导对这些信号响应的宿主遗传途径，以及鉴定可扩散信号的化学性质。