《Frontiers in Bioinformatics》：Identification and validation of biomarkers related to oxidative stress in pediatric sepsis utilizing WGCNA and multiple machine learning algorithms
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研究背景：本研究旨在识别新型氧化应激（oxidative stress, OS）相关生物标志物，并构建预测模型以实现儿童脓毒症的早期检测。方法：研究人员分析了来自基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）的5个公开数据集，包
研究背景：本研究旨在识别新型氧化应激（oxidative stress, OS）相关生物标志物，并构建预测模型以实现儿童脓毒症的早期检测。方法：研究人员分析了来自基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）的5个公开数据集，包含儿童脓毒症患者与健康对照的外周全血样本。通过生物信息学方法，研究人员鉴定了与氧化应激相关的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）。随后，研究人员联合加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）与多种机器学习算法（machine learning, ML）筛选出7个候选基因，构建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络以筛选6个核心基因（hub genes），并评估其与免疫微环境的相关性。研究人员随后利用训练数据集（GSE26440和GSE26378）及验证数据集（GSE13904、GSE8121和GSE9692）评估了核心基因的诊断效能。此外，分子对接分析揭示了核心基因编码蛋白与小分子化合物之间的相互作用，有助于预测药物敏感性。结果：研究共鉴定出36个差异表达的氧化应激相关基因（oxidative stress-related genes, OSRGs）。基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析强调了这些基因在调控炎症反应和活性氧代谢中的作用。通过机器学习算法鉴定出7个候选基因。随后，经PPI网络分析，GADD45A、HP、MAPK14、PGD、RETN和S100A9共6个核心基因被确认具有显著的诊断潜力。外周血转录组的免疫细胞反卷积分析提示，氧化应激相关核心基因可能与外周血免疫细胞组成的改变有关。6个核心基因的诊断性能经受试者工作特征曲线下面积（area under the curve, AUC）验证，数值介于0.908至0.982之间，展现了良好的诊断效能。此外，分子对接分析提示小分子化合物多西环素（Doxycycline）、Ralimetinib mesylate和Tasquinimod可能与本研究所鉴定的核心基因相互作用，为开辟新的治疗选择提供了可能。结论：本研究不仅揭示了儿童脓毒症的潜在诊断生物标志物，也为未来研究奠定了基础。这些研究旨在将研究结果转化至临床实践，从而实现更早期、更准确的诊断以及靶向治疗，以改善患儿的预后。
**儿童脓毒症氧化应激相关生物标志物的系统筛选与诊断价值评估——一项基于多数据集整合与多算法交叉验证的生物信息学研究**
**一、研究背景与科学问题**
脓毒症（sepsis）仍然是全球儿童死亡的主要原因之一，其本质是宿主对感染的免疫应答失调所引发的危及生命的器官功能障碍。流行病学数据显示，1990年至2017年间脓毒症约占全球年死亡总数的近20%，且儿童病死率显著高于成人。脓毒性休克（septic shock）作为脓毒症最严重的亚型，以循环衰竭合并细胞与代谢异常为特征，约半数确诊患儿在起病48小时内死亡。因此，在关键的最初数小时内实现快速识别和早期干预对于改善生存结局至关重要。值得注意的是，儿童脓毒症起病急骤、进展迅速且临床异质性显著，且儿童免疫系统处于持续发育过程中，感染后的炎症反应、器官功能变化及临床诊断标准均呈现年龄相关性特征，因此成人队列中筛选的候选标志物无法直接应用于儿童诊断场景。在氧化应激（oxidative stress, OS）层面，当活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生量超过机体抗氧化系统的中和能力时即引发OS，这种失衡驱动线粒体功能障碍，已被确认为脓毒症器官衰竭的核心病理生理机制之一。儿童脓毒症患者的临床研究已证实其存在显著的氧化应激标志物与抗氧化能力改变，提示氧化-抗氧化平衡紊乱在儿童脓毒症病理生理中发挥关键作用。然而，既往针对儿童脓毒症氧化应激相关生物标志物的系统筛选研究仍较有限，缺乏基于多数据集整合与多算法交叉验证的综合性分析。因此，本研究旨在利用公共转录组数据集，通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）与多种机器学习算法的联合策略，系统鉴定儿童脓毒症中氧化应激相关的诊断生物标志物，并评估其免疫微环境关联与药物敏感性，为临床早期诊断和靶向治疗提供分子基础。
**二、研究方法概述**
研究人员从基因表达综合数据库（GEO）获取5个儿童脓毒症外周全血转录组数据集（均基于GPL570平台），将GSE26440与GSE26378合并为训练队列，GSE13904、GSE9692与GSE8121合并为独立验证队列。数据预处理包括探针注释、基因符号映射、重复探针合并、缺失值剔除及log2转换；通过ComBat方法校正批次效应，并保留生物学分组信息。差异表达基因（DEGs）筛选标准为|log2FC|>0.585且校正后P值<0.05，与817个已知氧化应激相关基因取交集获得OS相关DEGs。功能富集分析采用GO和KEGG数据库，并使用基因集富集分析（GSEA）评估表型评分。共表达网络构建采用WGCNA，软阈值β=8，动态树切割识别模块并与临床性状关联。候选基因筛选综合6种机器学习算法（LASSO、袋装决策树、随机森林、贝叶斯分析、学习矢量量化（LVQ）和Boruta），以6/6一致性阈值确定最终候选基因。利用7种机器学习算法（Cancerclass、LogitBoost、AdaBoost、RF、支持向量机（SVM）、k近邻（k-NN）、朴素贝叶斯（NB））构建早期预测模型并在验证队列中评估。此外，通过STRING数据库构建PPI网络筛选核心基因，利用CIBERSORT进行22种免疫细胞反卷积分析，通过CB-Dock2平台执行分子对接评估药物-靶点结合潜力。
**三、主要研究结果**
**3.1 差异表达氧化应激相关基因的鉴定与富集分析**
在训练队列中鉴定出396个显著DEGs（290个上调，106个下调），与OS相关基因取交集获得36个OSRGs。GO富集分析显示这些基因富集于ROS代谢与炎症反应等生物学过程；KEGG通路分析鉴定出9条与脓毒症进展相关的通路，包括中性粒细胞胞外陷阱（NET）形成、Toll样受体（TLR）及NOD样受体信号通路，其中NET形成通路在脓毒症发病机制中尤为关键。
**3.2 氧化应激表型评分的功能解析**
OS表型评分在脓毒症队列中显著高于对照组（P<0.001）。GSEA显示高OS组富集了“ROS代谢过程”与“对OS的应答”等生物学过程，且脓毒症相关通路的激活增强，提示OS在疾病进展中的重要驱动作用。
**3.3 WGCNA关键模块识别**
在软阈值β=8时无标度拓扑拟合指数R2达到0.85，共获得14个共表达模块。其中“turquoise”模块与脓毒症呈强正相关（r=0.65，p=4.57×10?2?），模块成员关系与基因显著性的相关性分析（r=0.58，p=1.3×10???）确认该模块基因协同参与疾病关联。维恩图分析整合DEGs、OSRGs与关键模块基因获得31个交集基因。
**3.4 多机器学习算法交叉验证的候选基因**
6种机器学习算法各自筛选出不同数量的候选基因，通过6/6一致性标准最终确定7个共识候选基因：DDAH2、GADD45A、HP、MAPK14、PGD、RETN和S100A9。这种多算法交叉验证策略确保了筛选结果不依赖单一算法，提高结果的稳健性和可重复性。
**3.5 预测模型构建与核心基因PPI分析**
基于7种机器学习算法构建预测模型，在独立验证队列中比较AUC值，结果显示k-NN算法构建的模型具有最优诊断准确性，被选为最终预测模型。基于STRING数据库构建的PPI网络分析中，DDAH2因连接度较低被排除，最终保留6个核心基因：GADD45A、HP、MAPK14、PGD、RETN和S100A9。此外，基于核心基因构建的ceRNA网络包含102个节点和160条边，揭示了3个核心基因（GADD45A、MAPK14、PGD）与89个lncRNAs及10个miRNAs的潜在调控关系。
**3.6 外周血免疫细胞组成改变**
CIBERSORT反卷积分析显示脓毒症组与对照组之间免疫细胞相对比例存在显著差异。脓毒症组中M0巨噬细胞、M2巨噬细胞、单核细胞、活化肥大细胞和中性粒细胞比例显著升高（P<0.001），而滤泡辅助性T细胞、CD8 T细胞、CD4记忆T细胞、静息树突状细胞和活化NK细胞显著降低（P<0.001）。相关性分析显示大多数核心OSRGs与中性粒细胞呈正相关，与静息树突状细胞呈负相关。
**3.7 核心基因诊断效能验证**
在训练队列中，6个核心基因（S100A9、HP、PGD、MAPK14、GADD45A、RETN）在脓毒症组均显著上调，ROC曲线分析显示AUC值分别为0.951、0.982、0.964、0.944、0.962和0.982。基于6基因构建的诺模图（nomogram）模型AUC达0.994。独立验证队列确认了这些基因的显著上调，AUC值介于0.908至0.977之间，证实了其稳定的诊断潜力。
**3.8 分子对接与药物预测**
通过DGIdb和cMap数据库筛选候选化合物，并经CB-Dock2平台进行盲分子对接。MAPK14蛋白与多西环素（Doxycycline）及Ralimetinib mesylate显示强结合亲和力，AutoDock Vina评分分别为?8.4和?8.1 kcal/mol；S100A9蛋白与Tasquinimod的对接评分为?7.0 kcal/mol，提示这些化合物可能作为核心基因编码蛋白的潜在调控剂。
**四、讨论与结论**
本研究发现的核心基因（GADD45A、MAPK14、HP、PGD、RETN、S100A9）在脓毒症炎症放大和器官损伤中发挥作用：它们参与ROS代谢、介导炎症反应和免疫失衡，并激活MAPK/TLR/NOD样受体相关炎症通路。与传统的降钙素原（PCT）、C反应蛋白（CRP）和乳酸等临床标志物相比，该基因组合可能更灵敏地反映氧化应激和免疫失调相关的早期分子改变，提供互补的诊断信息。研究人员构建的ceRNA网络提示GADD45A、MAPK14和PGD可能受多种miRNA和lncRNAs的潜在转录后调控，但这些非编码RNA节点主要来源于数据库预测，需实验验证。研究局限性包括：基于公共回顾性数据集、未纳入临床变量与传统标志物的联合评估、未与已发表的成人和儿童脓毒症标志物特征进行直接比较、未使用多种反卷积算法交叉验证，以及分子对接结果需体外实验和临床研究验证。结论：本研究通过多数据集整合、WGCNA和多种机器学习算法的系统筛选，揭示了6个可作为儿童脓毒症潜在诊断生物标志物的氧化应激相关核心基因（GADD45A、HP、MAPK14、PGD、RETN、S100A9），并构建了具有良好诊断效能的预测模型。研究为深入理解氧化应激在儿童脓毒症发病机制中的作用提供了新的分子见解，为早期诊断和靶向治疗策略的开发奠定了理论基础。未来需通过前瞻性、多中心临床样本和实验验证以确证这些发现的临床转化价值。
