用于犬埃立克体血清诊断的金纳米颗粒增强酶联免疫吸附测定的开发与验证

《Veterinary Parasitology》：Development and validation of a gold nanoparticle-enhanced ELISA for serodiagnosis of Ehrlichia canis in dogs

# 主要内容

• **200只疑似犬莫氏锥虫病（CME）犬只**：115只（57.5%）qPCR阳性，85只（42.5%）阴性；30只对照组
• **Nano-ELISA**：灵敏度98.3%，特异度97.6%，准确度98.0%，AUC 0.980，κ 0.96
• **i-ELISA**：灵敏度96.5%，特异度94.1%，准确度95.5%，AUC 0.953，κ = 0.91
• **Nano-ELISA在所有指标上均领先，但差异无统计学意义（DeLong/McNemar检验）**
• **Nano-ELISA无交叉反应（0/30），而i-ELISA为3.3%（1/30）；检测面板较小**
• **Nano-ELISA可检测E. canis暴露，与qPCR结果一致；需多中心验证**

## 引言

虫媒传染病（VBDs）对全球人类、家畜、伴侣动物和野生动物的健康构成日益严重的重要威胁（Kule?等，2017年）。除了对动物福利的直接危害外，虫媒传染病还会通过增加牲畜和宠物群体中的发病率和死亡率而带来巨大的经济负担（Lew-Tabor & Valle，2016年）。在影响犬只的虫媒传染病中，由专性胞内革兰氏阴性菌——无形体科、立克次体目的犬埃立克体（Ehrlichia canis）引起的犬单核细胞埃立克体病（CME），是最具临床重要性的蜱传立克次体病之一（Rikihisa，1991年；Dumler和Bakken，1995年）。该病原体主要通过广义的血红扇头蜱（Rhipicephalus sanguineus sensu lato）在若虫期和成虫期传播（Groves等，1975年；Ipek等，2018年），并优先感染循环中的单核细胞和巨噬细胞，在称为桑葚体的膜结合胞质液泡内增殖（Harrus等，1998年）。

CME呈三相临床过程，包括急性期、亚临床期和慢性期。患病犬只在急性期通常表现为发热、精神萎靡、食欲减退、淋巴结肿大和血小板减少。若未接受适当治疗，疾病可能进展为慢性形式，特征为骨髓增生低下、全血细胞减少，以及可能致命的出血倾向（Buhles等，1974年；Harrus和Waner，2011年）。德国牧羊犬似乎对严重的慢性形式有不成比例的高易感性，其相关发病率和死亡率高于其他品种（Nyindo等，1980年）。疾病严重程度也可能受到其他由广义R. sanguineus传播病原体的共感染的影响，包括在相同疫区流行的血小板无形体（Anaplasma platys）和沃氏巴贝斯虫（Babesia vogeli），这些共感染可能改变病理生理结局（Gal等，2007年；Gaunt等，2010年）。Ehrlichia canis在埃及呈地方性流行，已在多个犬群中得到证实（Stillman等，2014年；Senbill等，2024年；Khalifa等，2025年）。

早期和准确的诊断对于启动及时的强力霉素治疗并防止疾病进展为不可逆的慢性病至关重要。现有的诊断工具包括吉姆萨染色血涂片中桑葚体的细胞学识别、血清学检测和分子方法。在循环单核细胞中显微镜下识别桑葚体在感染急性期最有效，此时桑葚体最有可能出现在外周血中；然而，总体而言灵敏度仍然较低，因为在亚临床期和慢性期仅能在4%–20%的自然感染犬只中检测到虫血症（Mylonakis等，2003年；Harrus和Waner，2011年）。细胞培养分离是最确切的方法，但其耗时费力且速度慢，不适用于常规临床使用（Iqbal等，1994年）。

血清学方法广泛用于CME的诊断，在结合分子学确认解读时最为有价值，因为仅凭抗体检测无法确立活动性感染。自间接免疫荧光抗体试验（IFAT）于1972年开发以来，它一直是应用最广泛的血清学诊断工具（Ristic等，1972年；Waner等，2001年），被视为血清学参考方法；然而，其读数具有主观性，且由于与犬埃立克体（Ehrlichia canis）和查菲埃立克体（Ehrlichia chaffeensis）之间存在共享交叉反应抗原，无法持续区分这两种病原体（Bélanger等，2002年）。ELISA平台因其适应性和高通量而在临床实践中得到广泛应用（McBride等，2001年；McBride等，2003年；Liu等，2018年）。然而，基于全菌抗原粗制剂的传统ELISA格式容易与无形体科的近缘成员发生非特异性交叉反应（O'Connor等，2006年；Beall等，2012年）。仅凭血清学检测无法区分活动性感染与既往暴露，因为抗体滴度在感染清除后可持续数月甚至超过一年（Harrus等，1998年；Waner等，2001年）。

基于PCR的分子检测在以下方面优于血清学：检测活动性病原体DNA而非抗体反应，提供种水平分辨率，并可在血清转换前实现早期诊断。靶向二硫键形成蛋白B（dsb）基因的TaqMan定量PCR（qPCR）日益被视为分子确诊的首选方法，具有高分辨分析灵敏度和定量精度（Doyle等，2005年；Harrus和Waner，2011年；Khumtub等，2024年）。与靶向p28基因的单步PCR检测（Nakaghi等，2010年）和靶向16S rRNA基因的巢式PCR方法（Wen等，1997年）的比较表明，TaqMan dsb qPCR具有有利的分析灵敏度。互补的分子靶点如groESL热激操纵子（Sumner等，1997年）进一步完善了埃立克体属内的种水平鉴别。

纳米技术为克服传统ELISA的灵敏度局限性提供了另一条途径。金纳米颗粒（AuNPs）具有独特的理化特性，包括高比表面积、归因于局域表面等离子体共振（LSPR）的可调光学特性以及增强的生物分子偶联能力——这些特性可在不牺牲特异性的前提下放大免疫检测信号（Dykman和Khlebtsov，2012年；Tabatabaei等，2021年）。将AuNPs整合到ELISA检测步骤中可增加每次结合事件中的催化活性酶单位数量，从而提高信噪比和分析灵敏度。我们课题组此前已证明金纳米颗粒增强ELISA在犬巴贝斯虫病血清诊断中的效用，与传统间接ELISA（i-ELISA）相比，其诊断指标有所改善（Attia等，2026年）。在相关应用中，Bunroddith等（2018年）报道，将纳米颗粒整合到石英晶体微天平生物传感器平台中用于E. canis PCR扩增产物检测，实现了22拷贝/mL的检测限，并对其他犬血寄生虫具有高度选择性，这突显了纳米颗粒增强诊断在该病原体检测方面的分析潜力。

因此，本研究旨在：（i）开发并验证一种金纳米颗粒增强ELISA（Nano-ELISA），用于由E. canis引起的CME血清诊断；（ii）以dsb TaqMan qPCR作为唯一的分子参考标准，将其诊断性能与传统i-ELISA进行比较；（iii）对合成的金纳米颗粒及其蛋白偶联物进行理化表征。

## 伦理审批与报告标准

所有程序均按照《实验动物指南》和埃及开罗大学兽医学院样本采集指南进行，审批编号为Vet CU 25122023848，并符合埃及国家动物实验法规。在纳入研究前，已征得每只犬所有者的知情书面同意。本研究按照STARD 2015诊断准确性研究报告指南进行报告。

## 样本量

纳入200只犬只。

## 研究人群与qPCR参考分类

在纳入的200只犬中，115只经dsb TaqMan qPCR分类为E. canis阳性（Cq ≤38；阳性率57.5%；95% CI：50.5–64.4%），85只分类为qPCR阴性（Cq >38或未确定）。阳性犬的Cq值范围为24.3至38.0（均值 ± 标准差：31.4 ± 3.7），反映了临床队列中广泛的病原体负荷差异。内部GAPDH提取对照在所有200个样本中均被扩增（Cq 22.1–25.4），确认了DNA质量合格且无PCR抑制。

## 讨论

本研究开发并验证了一种用于CME血清诊断的金纳米颗粒增强ELISA（Nano-ELISA），使用福尔马林灭活的E. canis抗原和AuNP–Protein A/G–HRP偶联物进行信号放大，并以dsb TaqMan qPCR作为唯一的分子参考标准进行基准评估。主要发现如下：（i）Nano-ELISA的灵敏度（98.3%对96.5%；McNemar检验 p = 0.50）和特异度（97.6%对……

## 结论

在这一单中心临床疑似犬队列中，AuNP增强ELISA与dsb TaqMan qPCR显示高度一致性，其诊断指标数值上高于传统间接ELISA。然而，两种格式之间的差异在主分析中无统计学意义，且以qPCR作为唯一参考标准限制了解读，因为血清学和qPCR测量的是不同的生物学状态。需要独立的多中心验证和更广泛的……

## 创新性

这是第一项开发并验证用于E. canis血清诊断的金纳米颗粒增强ELISA的研究，并将其直接与dsb TaqMan qPCR参考标准进行基准比较，证明胶体金信号放大可以整合到常规ELISA格式中，且成本远低于分子检测。在本队列中，该格式实现了接近分子检测水平的诊断指标，且在三种共地方性病原体中未观察到交叉反应。

## 伦理审批

所有程序均按照《实验动物指南》和埃及开罗大学兽医学院样本采集指南进行，审批编号为Vet CU 25122023848，并符合埃及国家动物实验法规。在纳入研究前，已征得每只犬所有者的知情书面同意。没有任何客户饲养的动物接受了除第2.3节所述单次诊断性血液采样之外的任何操作。

## CRediT作者贡献声明

Marwa M. Attia：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿，可视化，验证，监督，资源，项目管理，方法论，调查，经费获取，形式化分析，数据整理，概念构思。
Reda Abdel Hameed：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿，可视化，验证，监督，软件，资源，项目管理，方法论，调查，经费获取，形式化分析，数据整理。

## 利益冲突声明

作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所述工作的报告。

## 致谢

本研究由沙特阿拉伯海伊勒大学科学研究司通过项目编号RG-25007提供资助。

## 利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

Reda Abdel Hameed | Marwa M. Attia | Hanan H. Abd-Elhafeez | Asmaa Hegazy | Eshraqa Ali | Kaseb D. Alanazi | Ayham Ali Bani Essa | Badr Huwaimel | Sara Abdelsayed | M. Abdullah | Mohamed Abdelsalam