《Frontiers in Bioinformatics》：Strategic roadmap for FAIR-compliant transcriptomic workflows: from technical challenges to bioinformatics democratization
本文基于作者在转录组学研究领域超过17年的经验，以2009年高通量测序技术引入墨西哥为起点，对不同RNA类别（从小RNA到长链非编码RNA）的生物信息学流程进行了批判性综述。研究人员的分析涵盖了多种情景，从对缺乏密切相关且注释充分的参考基因组的生物体进行从头转录组组装，到基于注释良好的参考基因组进行差异表达分析。通过提供从RNA提取和高通量测序到质量控制和数据预处理的整个工作流程的综合概述，研究人员提出了一个实用框架，以帮助研究人员选择适合其生物学问题和实验背景的工具。研究人员进一步审视了转录组组装、序列比对和转录本丰度定量的高级策略。最后，研究人员讨论了差异表达和功能富集分析，强调了标准化、符合FAIR原则的工作流程以及转录组学分析民主化在促进包容性和可重复性基因组研究中的重要性。研究人员还介绍了IDEAMEX，这是一个基于网络的平台，旨在通过减少技术和系统性障碍，并促进公平获取稳健分析工具，来实现转录组学分析的民主化，尤其面向资源有限环境中缺乏高级编程技能的研究人员。
1 引言
高通量RNA测序（RNA-seq）的出现彻底改变了人们对基因调控、细胞功能和疾病机制的理解。在墨西哥，这一范式转变始于2009年，当时该国第一台Illumina测序系统安装在墨西哥国立自治大学生物技术研究所的高通量测序和生物信息学大学部门（UUSMB）。尽管这些技术的采用促进了全国生物信息学研究的发展，但女性在该领域的代表性仍然不足，正如在其他STEM学科中一样（根据墨西哥研究人员注册数据库：https://www.datos.gob.mx/dataset/sistema_nacional_investigadoras_investigadores_snii_s191）。在此背景下，考虑到她们获得基本计算资源的机会有限、缺乏有针对性的指导和培训机会，以及可能阻碍其职业发展的制度性不平等，她们取得的成就尤其值得关注。
全转录组分析检查生物样本中的总RNA，已成为当代分子生物学的基石，因为它能够在单次实验中表征编码和非编码基因的表达。这种综合方法已在不同领域实现了广泛的变革性应用。在农业和动物科学中，它促进了兽医寄生虫学（Reyes-Guerrero et al., 2023）、硬骨鱼生理学（Corona-Herrera et al., 2022）和植物-病原体相互作用（Solano-De la Cruz et al., 2019）的重要进展。它也是基因组医学中研究病理机制（Beltrán-Hernández et al., 2025）、药理学中跨生物体进行分子水平研究（López-Teros et al., 2025）以及结构生物学中检查转录过程中小RNA功能（Sánchez-Correa et al., 2022）的重要工具。
然而，转录组分析涉及广泛的数据处理，并且需要仔细考虑每个阶段使用的算法。根据研究人员在UUSMB的经验，研究人员观察到，从初始数据处理到最终解释的每个步骤都可能引入偏差，从而显著影响生物学结论（Conesa et al., 2016; Mandelboum et al., 2019; Molania et al., 2023）。这些技术挑战，加上转录组分析的计算需求，可能对寻求发展必要生物信息学技能的研究人员构成重大障碍。
本研究的目标是提供专家视角和对转录组分析中关键算法的战略评估，借鉴该领域超过17年的经验。研究人员研究了工作流程的选择如何依赖于基因组资源的可用性，并考虑了三种主要情景：使用注释良好的参考基因组、使用密切相关的注释生物体以促进转录组组装，以及非模式物种从头组装的更具挑战性的任务。最后，研究人员评估了这些策略应如何适应不同的RNA类别，包括信使RNA（mRNA）、小RNA（sRNA）和长链非编码RNA（lncRNA）。
2 转录组学工作流的战略方法框架
一个稳健的转录组学工作流始于RNA提取，随后使用高通量测序平台进行测序。这些技术生成包含来自转录组的测序读段的FASTQ格式原始数据。在以下章节中，研究人员评估了当代转录组学研究的不同阶段，并强调了确保生物学有效性和可重复性所需的关键方法决策。
2.1 RNA-seq中的工作流程
在RNA-seq领域，最广泛使用的方法包括mRNA、sRNA和总RNA测序（Conesa et al., 2016; Coussement et al., 2024; Lee et al., 2024）。mRNA测序已成为分析病理条件（Beltrán-Hernández et al., 2025）、生物过程（Vichi et al., 2021）和多种实验环境中转录组的广泛使用的方法。除了提供灵敏且准确的基因表达测量（Li and Dewey, 2011; Patro et al., 2017）外，mRNA-seq还能够识别转录本异构体、基因融合和其他已知及新型转录组特征，以及等位基因特异性表达。基于下一代测序（NGS）的mRNA-seq提供了编码转录组的全面视图，无需事先广泛了解转录本结构（Kukurba and Montgomery, 2015; Wang et al., 2009）。此外，链特异性mRNA-seq可以提供转录本方向的信息，从而能够检测反义转录本、更准确地量化重叠转录本，以及更高比例的可比对读段（Levin et al., 2010）。非编码sRNA在基因沉默和基因表达的转录后调控中发挥重要作用（Mahamadou et al., 2026）。sRNA测序能够分离和测序sRNA种类，包括微RNA（miRNA）。RNA-seq可以促进对数千种sRNA和miRNA序列的高灵敏度、宽动态范围分析。总RNA测序提供了一种检测编码RNA和多种非编码RNA的综合方法。它能够量化基因和转录本丰度，并识别已知和新型转录组特征。特别是，总RNA测序促进了编码RNA和多种非编码RNA类别（包括lncRNA）的同时分析，从而提供更全面的转录组视图（Stark et al., 2019）。
2.2 实验设计
如果转录组学研究的目标之一是进行差异表达分析，实验设计应包括基线或参考条件（例如野生型条件）和比较条件。后者可能代表由特定环境条件、药物暴露或疾病状态产生的实验处理，或涉及突变体或遗传变异体、不同组织或其他生物学相关的比较。生物学重复也是设计转录组实验时的重要考虑因素。大量文献表明，增加生物学重复的数量可以提高实验发现的可靠性和解释力（Schürch et al., 2016）。研究人员认识到，增加生物学重复数量会显著增加实验成本，并可能带来后勤挑战。然而，足够的生物学重复对于准确估计生物学变异和提高差异表达分析的统计功效至关重要。稳健的实验设计应区分生物学变异与技术变异，以确保转录组发现的可靠性。批次效应是一种技术变异形式，当生物样本在不同的批次、不同的日子、不同的实验室或由不同的技术人员处理时发生。这种系统性偏差有可能在高通量实验环境中掩盖或歪曲真实的生物学变异。这可能通过产生假阳性（将基因识别为“差异表达”，而实际上差异是由于测序日期所致）对研究产生有害影响。这种现象还可能导致统计功效的降低，因为技术噪声往往超过感兴趣的生物学信号。批次效应是技术变异的重要来源，当来自相同实验条件的样本在不同时间、由不同人员或在不一致的环境条件下制备或测序时发生（Leek et al., 2010; Coussement et al., 2024）。凭借在UUSMB超过17年的经验，研究人员发现RNA提取是工作流程中特别敏感的阶段，在此阶段处理时间、温度和试剂批次的微小差异都可能引入系统性变异并增加所得数据的离散度。为了检测此类技术伪影，可以对归一化表达数据进行探索性分析，包括主成分分析（PCA）和多维标度（MDS），理想情况下使用最具变异性的基因。这些分析有助于识别与处理批次而非生物学条件相关的聚类模式。一旦识别出批次效应，可以通过将批次作为协变量纳入诸如DESeq2或edgeR等统计框架中来解释，从而提高检测真实差异表达基因（DEG）的能力。
在UUSMB，三个生物学重复通常被认为是最低可接受数量，尽管不应将其视为最佳数量。然而，Schürch等人（2016）报告称，增加重复数量（例如6-12个重复）可以显著提高DEG的检测。尽管三个重复传统上被用作差异表达分析的最低数量，但这个数量可能不足以充分捕获生物学变异或检测小幅度表达变化（Schürch et al., 2016）。正如多项研究（Corona-Herrera et al., 2022; López-Teros et al., 2025; Reyes-Guerrero et al., 2023; Sánchez-Correa et al., 2022）所报告的那样，在检测表达变化超过两倍（log2FC ≥ 2）的基因时，至少三个生物学重复可以获得满意结果，特别是当重复间变异性低或使用相对同质的生物材料（如细胞系）时。然而，涉及患者样本或远交动物模型（包括鱼类）的研究通常需要更多生物学重复，因为存在显著的个体间变异。六个或更多生物学重复可能在实验成本与检测DEG所需的统计功效之间提供有用的平衡，尽管最佳数量应根据预期的生物学变异和效应大小来确定（Liu et al., 2014; Schurch et al., 2016）。该建议特别适用于生物学重复。在控制良好的实验条件下，RNA-seq的技术变异相对较低且可预测，因此不会引入显著的下游偏差（Marioni et al., 2008）。总体而言，增加生物学重复数量通常会提高统计功效，并提高区分生物学效应与背景变异的能力。
除了重复数量外，在设计RNA-seq实验时还应考虑测序深度。多项已发表的RNA-seq研究已成功使用每个样本约1000万读段来识别DEG（Vichi et al., 2021; Reyes-Guerrero et al., 2023; Corona-Herrera et al., 2022）。然而，这些例子不应被解释为建立普遍的测序深度阈值，因为所需深度取决于转录组复杂性、转录本丰度、生物学变异、预期效应大小和研究目标（Sims et al., 2014）。较低的测序深度可能足以检测高表达转录本，而更大的测序深度可以提高复杂转录组中低表达基因的检测（Sims et al., 2014）。因此，测序深度应结合生物学重复和实验的具体目标来考虑，而不是仅由所研究的生物体决定。最后，在实验设计期间还应考虑RNA制备策略。去除或移除高丰度核糖体RNA（rRNA）可以增加分配给信息性转录本的测序读段比例，从而影响有效测序深度（Conesa et al., 2016）。
2.3 mRNA提取
mRNA提取是一种分子生物学程序，旨在从其他细胞成分（包括DNA、蛋白质、tRNA和rRNA）中分离信使RNA。与总RNA不同，mRNA仅占细胞RNA的一小部分，通常约占总RNA的2%-5%。大多数成熟真核mRNA的一个显著特征是3'端存在poly(A)尾。因此，为了选择性构建mRNA-seq文库并减少高丰度核糖体RNA的测序，可以通过与磁珠偶联的poly(dT)寡核苷酸捕获多聚腺苷酸化转录本来富集mRNA。或者，寻求更全面转录组谱的研究人员可以使用核糖体RNA去除来保留非多聚腺苷酸化非编码RNA（Perez-Perri et al., 2021）。
RNA分离的主要方法包括硅胶柱、有机提取试剂（如TRIzol）和磁珠。基于磁珠的方法广泛用于下游文库制备，既可用于使用oligo(dT)磁珠阳性选择mRNA，也可用于阴性选择去除核糖体RNA（rRNA），后者约占总RNA的80%-90%。后一种方法增加了来自感兴趣转录本的测序读段比例（Hrdlickova et al., 2017; Kukurba and Montgomery, 2015）。
对于sRNA分析，可以使用适当调整乙醇浓度的硅胶膜选择性地保留或回收小RNA组分，通常为短于200个核苷酸的组分（Head et al., 2014）。为了富集调控性sRNA（如约18-30 nt的sRNA）并在文库制备过程中去除接头二聚体，样本传统上经过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），然后切除相应条带（Baran-Gale et al., 2015; Head et al., 2014）。自动电泳和基于磁珠的大小选择方法也越来越多。重要的是，oligo(dT)富集通常不适用于大多数sRNA，因为它们缺乏poly(A)尾。相反，在文库制备过程中，专门的单链接头直接连接到RNA分子上（Baran-Gale et al., 2015）。
对于lncRNA分析，与其选择性捕获目标转录本，不如使用阴性选择策略来去除不需要的RNA种类。具体而言，可以使用与核糖体RNA（rRNA）结合的目标探针来促进其酶促降解或从样本中物理去除（Cui et al., 2010）。这种方法特别有用，因为lncRNA结构多样，可以是多聚腺苷酸化的，也可以是非多聚腺苷酸化的（Bush et al., 2017）。因此，基于oligo(dT)的mRNA富集可能不可逆地排除缺乏3'poly(A)尾的lncRNA。核糖体RNA去除可以克服这一限制，通过保留蛋白质编码mRNA和非多聚腺苷酸化lncRNA，从而提供更全面的转录组代表（Cui et al., 2010; Bush et al., 2017）。
2.4 高通量RNA-seq
RNA-seq使用高通量测序技术来表征细胞或生物样本的转录组。与微阵列不同，RNA-seq不需要事先了解待分析的基因或转录本。除了量化基因表达外，这种方法还可以检测新型转录本变体、稀有剪接事件和低丰度转录本。对于从头转录组组装（即不依赖于参考基因组而组装读段），长读段测序技术，如Oxford Nanopore Technologies（ONT）和Pacific Biosciences（PacBio）提供的技术，可以提供重要优势（Hu et al., 2026）。长读段测序的主要限制之一是其相对于短读段测序的成本较高（Amarasinghe, S. L., et al., 2020）。根据平台和实验设计，长读段测序的成本可能远高于基于Illumina的短读段测序。使用短读段进行从头转录组组装的一个主要挑战是难以从相对较短的序列片段中准确重建转录本异构体和重复区域（H?lzer and Marz, 2019）。长读段测序可以通过生成跨越更大部分甚至有时整个转录本的读段来帮助解决这一限制。PacBio平台（如Revio和Sequel IIe）使用高精度HiFi读段，因此代表了转录组测序的合适选择（Logsdon et al., 2020）。PacBio HiFi测序可以实现非常高的单读段准确性，使其特别有助于解析转录本结构和异构体（Wenger et al., 2019）。这种方法可以通过提供跨越多个外显子的读段来简化转录组组装，从而减少与外显子连接重建相关的不确定性（Hu et al., 2026）。另一种选择是使用ONT测序，如MinION或PromethION平台。ONT可以提供长读段，并且根据工作流程，某些应用可能提供更方便的选择，尽管成本仍高于常规Illumina测序。此外，ONT支持直接RNA测序，不需要将RNA转化为cDNA（Garalde et al., 2018）。直接RNA测序可以减少与逆转录和PCR扩增相关的一些偏差，还可以检测RNA碱基修饰（Logsdon et al., 2020）。
转录组测序的常规方法是使用Illumina平台进行短读段测序，包括NovaSeq 6000、NextSeq 2000、NextSeq 500和MiSeq（Stoler and Nekrutenko, 2021）。这些系统因其低测序错误率、高通量和相对较低的每碱基成本而被广泛使用（Stark et al., 2019）。然而，从短读段进行从头转录组组装需要复杂的生物信息学方法，包括Trinity等软件，以从重叠序列片段重建转录本。这个过程可能产生嵌合序列或不完整的转录本重建。然而，注释良好的参考基因组的可用性可以显著简化转录本重建和下游分析。
对于使用参考基因组进行差异表达分析，Illumina短读段测序通常是涉及大量样本和生物学重复的研究的成本效益选择。首先，当需要处理许多样本时，它通常比PacBio或ONT测序更经济，这对于在差异表达研究中实现足够的统计功效尤为重要（Conesa et al., 2016）。其次，当合适的参考基因组可用时，不一定要用长读段来重建基因。短读段（通常约50-300 bp，取决于测序平台和实验设计）可以比对到参考基因组，并用于量化转录本或基因丰度。第三，Illumina平台可以以相对较低的成本生成每个样本的大量读段，增加了检测低丰度转录本的可能性，并为表达分析提供了宽动态范围（Stark et al., 2019）。当主要目标是基因表达量化时，约75-100 bp的单端读段可能就足够了，尽管最佳读段配置取决于实验设计和转录组复杂性。这一考虑与sRNA测序尤其相关。当感兴趣的是转录本结构、异构体重建或选择性剪接事件时，通常优选双端测序，因为来自两端的读段提供了解决转录本结构的额外信息（Stark et al., 2019）。即使有参考基因组可用，ONT或其他长读段技术对于具有高度重复或结构复杂的基因组区域（包括一些植物和哺乳动物基因组）的生物体可能是有利的。
2.5 质量控制（QC）和数据清理
质量控制（QC）和数据清理是转录组分析的重要组成部分，特别是对于RNA-seq，因为在这些阶段引入的错误或技术伪影可能影响下游结果（Paton et al., 2024）。数据清理是一个多步骤过程，旨在去除技术伪影、不需要的序列和低质量读段，以确保后续分析（包括差异表达和功能富集）基于可靠数据。
该过程通常始于使用FastQC等专业工具对原始测序质量进行全面评估（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）。FastQC可以识别接头污染、潜在序列污染物、核苷酸组成偏差以及测序读段中的其他质量问题。
MultiQC（Ewels et al., 2016）是另一个用于评估和汇总多个样本测序质量的有用工具。在此初步评估之后，可以根据需要执行读段预处理。根据识别的质量问题，预处理可能包括接头去除、基于平均或每碱基质量的读段过滤，以及从读段5'或3'端修剪碱基。
有多种工具可用于读段预处理。例如，Cutadapt（Martin, 2011）可以检测并从高通量测序读段中去除接头序列、引物、poly(A)尾和其他不需要的序列。Illumina已在其sRNA测序工作流程中整合了相关的接头修剪方法。另一个广泛使用的选项是fastp（Chen et al., 2018），它将对接头修剪、质量评估和读段过滤整合到单个工作流程中。其C++实现使得能够快速处理大型测序数据集。Trimmomatic（Bolger et al., 2014）是另一种常用于接头修剪和去除低质量碱基和读段的工具。这个基于Java的程序已被广泛用于RNA-seq和DNA测序数据。AdapterRemoval（Schubert et al., 2016）提供了额外的功能，用于识别和去除接头序列以及合并重叠的双端读段。
对于长读段测序，可以使用NanoPlot评估读段质量，然后使用Chopper等工具进行接头去除和读段修剪。这些工具是NanoPack2套件的一部分（DeCoster and Rademakers, 2023）。对于Oxford Nanopore长读段数据，Porechop_ABI专门用于接头检测和去除（Bonenfant et al., 2022）。该工具特别有助于识别和去除嵌合或中间接头序列，从而提高长读段数据集的完整性。
2.6 从头转录本组装
当没有注释充分的参考基因组可用时，可能需要进行从头转录组组装。如第2.4节所述，多种测序策略可用于此目的。然而，没有单一的转录本组装方法可以在所有数据集和质量指标上被认为是最优的。鉴于可用软件工具的广泛性（Raghavan et al., 2022），组装器的选择应受测序技术、读段长度、读段准确性、转录组复杂性和研究具体目标等因素的指导。对于Illumina短读段RNA-seq数据，基于de Bruijn图的方法被广泛用于重建转录本。Trinity和rnaSPAdes是为此目的建立的工具之一。
Trinity使用三阶段组装过程。首先，Inchworm通过使用贪婪方法识别k-mer图中的路径来组装读段，生成一组线性重叠群。其次，Chrysalis对相关重叠群进行分组，并为每组构建单独的de Bruijn图。第三，Butterfly处理这些图，去除虚假边并简化线性路径，然后与读段和读段对进行协调，以重建代表选择性剪接形式和旁系同源转录本的转录本序列（Grabherr et al., 2011）。
类似地，rnaSPAdes使用基于浓缩de Bruijn图的多步骤方法。该过程包括图构建和去除错误或嵌合边、将读段对映射到组装图、使用exSPAnder算法进行重复解析和支架搭建，以及通过评估图中的路径提取最终转录本和异构体序列（Bushmanova et al., 2019）。组合Trinity和rnaSPAdes可能提供互补信息，在评估从头组装时可以考虑。
对于使用PacBio或ONT平台进行的测序，RNA-Bloom2（Nip et al., 2023）是用于从头转录组组装的有用选项。最近的基准测试研究报告了RNA-Bloom2在ONT cDNA、ONT直接RNA和PacBio数据集上的强大性能，考虑了组装准确性、计算效率和整体性能等因素。该软件可以处理大型测序数据集并重建转录本，同时将读段解析为不同的异构体。另一个选择是isONform（Petri and Sahlin, 2023），专为从Oxford Nanopore或PacBio测序生成的全长异构体读段进行转录组组装而设计。它在重建选择性转录本异构体方面表现出强大的性能。RATTLE（De la Rubia et al., 2022）是另一种为长读段数据设计的从头方法，特别是Oxford Nanopore直接RNA和cDNA测序。它在不需要参考基因组的情况下执行转录本校正和重建。rnaSPAdes也可以作为替代方案考虑，尽管它最初主要针对短读段数据开发。因此，其对长读段数据集的适用性应根据具体测序技术和数据集特征进行评估，而不是假设其与短读段性能相当。
当高质量参考基因组可用时，StringTie2（Kovaka et al., 2019）是广泛使用的转录本组装和量化工具。对于长读段数据，StringTie2可以有效重建转录本结构，即使在缺乏全面参考注释的情况下也能识别新异构体。更重要的是，该软件专门针对管理PacBio和Oxford Nanopore数据特有的较高错误率进行了优化。
2.6.1 从头转录组组装的评估
有几种计算工具可用于评估从头转录组组装的质量。DETONATE（Li et al., 2014），代表DE novo TranscriptOme rNa-seq Assembly with or without the Truth Evaluation，由两个组件包组成：RSEM-EVAL和REF-EVAL。RSEM-EVAL是一种基于概率模型的无参考评估方法，仅使用组装和用于生成组装的RNA-seq读段。REF-EVAL是一个基于参考的指标工具包，包括重叠群、核苷酸和配对水平的精确度、召回率和F1分数，以及k-mer压缩分数和几种比较组装与参考之间k-mer分布的度量。CATS（转录本序列的全面评估）（Boduli? and Vlahovi?ek, 2026）也提供了基于无参考（CATS-rf）和基于参考（CATS-rb）的转录组质量评估流程。CATS-rf将RNA-seq读段映射到组装的转录本，并计算四个可解释的评分组件，以捕获常见的组装错误。CATS-rb通过将组装的转录本比对到参考基因组来评估转录组完整性，并支持无注释和基于注释的评分。TransRate（Smith et al., 2016）是一种开源工具，无需参考基因组即可评估从头转录组组装。通过分析组装并将读段映射回组装的转录本，TransRate可以识别潜在问题，如嵌合转录本和序列错误，并可用于比较组装和过滤低质量重叠群。rnaQUAST（Bushmanova et al., 2016）是另一种用于评估从头转录组组装的综合工具。它计算转录本长度、N50、完整和部分BUSCO恢复以及GeneMarkS-T统计等指标。该工具可以使用参考基因组和GTF/GFF格式的基因注释来评估组装。
评估工具的选择应由分析的具体目标和可用数据指导，因为这些工具的功能有所重叠。当需要基于无参考（CATS-rf）和基于参考（CATS-rb）的评估时，CATS（Boduli? and Vlahovi?ek, 2026）是一个有用的选择。当高质量参考基因组和相应的GTF/GFF注释可用时，rnaQUAST提供了一组全面的组装质量指标。对于无法获得参考基因组的非模式生物，可以使用TransRate基于读段支持来评估组装质量。DETONATE特别适用于使用不同参数设置生成的组装的概率评估和比较。
评估组装质量只是转录组重建的一个组成部分；所得组装可能还需要后处理以减少冗余并去除支持不足的转录本。CD-HIT-EST是CD-HIT包（Li and Godzik, 2006）的一部分，是一种生物信息学工具，旨在根据指定的序列相似性阈值对核苷酸序列（包括DNA和RNA）进行聚类。它可以用于减少序列冗余并生成非冗余序列数据库，特别适用于相对相似或冗余的转录本序列，包括组装的转录组和表达序列标签（EST）。Corset（Davidson and Oshlack, 2014）是一种命令行工具，根据共享的读段映射模式将从头转录组组装中的重叠群分组为基因水平聚类，从而促进下游差异基因表达（DGE）分析。这种方法有助于解释转录本冗余，并可以在表达量化之前对选择性剪接转录本和旁系同源序列进行分组。
2.6.2 从头转录本的注释
在从头组装并去除冗余或低质量转录本后，下一步是注释重建的转录本。Trinotate是一个为从头转录组（特别是使用Trinity生成的转录组）设计的功能注释套件。它将多种生物信息学工具的结果整合到一个统一的SQLite数据库中，为重建的转录本及其预测蛋白质提供功能信息。Trinotate作为中央框架，通过以下功能注释和预测流程处理转录本序列：
序列预测：使用TransDecoder（Hass et al., 2013）预测长开放阅读框（ORF）并将其翻译成预测的蛋白质序列。
同源性搜索（BLAST, Altschul et al., 1990）：使用BLASTX搜索转录本序列，而使用BLASTP搜索由TransDecoder生成的预测蛋白质序列，针对Swiss-Prot或UniProt等蛋白质数据库进行，以识别同源蛋白质。
结构域鉴定：使用HMMER（Eddy, 1998）结合Pfam数据库来识别保守蛋白质结构域。
特征预测：使用SignalP（Teufel et al., 2022）预测信号肽，使用TMHMM（Krogh et al., 2001）识别跨膜区域。
功能注释：可以使用Pfam（Mistry et al., 2021）分配额外的功能信息以识别蛋白质家族和功能结构域，使用Gene Ontology（GO）术语（geneontology.org）进行功能分类和下游富集分析，以及使用EggNOG（Huerta-Cepas et al., 2017）和KOG分类（Tatusov et al., 2003）进行更广泛的直系同源组分配。
2.7 比对
在从头转录组组装或选择合适的参考基因组之后，下一步是将测序读段比对到参考序列。当参考基因组可用时，可以使用剪接感知比对器，如HISAT2和STAR。当没有参考基因组时，可以根据分析目标使用BWA或Bowtie2等工具将读段比对到从头转录组组装。所得的比对可用于转录本或基因丰度估计。目前有超过100种序列比对软件工具可用，使其成为许多基因组和转录组分析中的基本步骤。因此，从广泛的可用选项中选择合适的比对器可能具有挑战性（Mushi et al., 2021）。在此，研究人员专注于广泛使用且与转录组工作流程特别相关的工具。这些比对器以其速度、准确性、内存需求和识别剪接连接及其他转录组特征的能力而著称（Coxe et al., 2024; Mushi et al., 2021）。
转录本剪接比对分层索引2（HISAT2）是一种专为RNA-seq数据设计的剪接感知比对器，是TopHat2的继任者。其特点是处理速度快、内存需求相对较低，适用于将RNA-seq读段比对到参考基因组。HISAT2还可以识别已知和新的剪接位点，这是转录组分析的重要特征。该程序使用基于Burrows-Wheeler变换和Ferragina-Mannzini（FM）索引的分层索引策略，以高效地将测序读段比对到参考基因组（Kim et al., 2019）。其索引策略还可在适当时纳入已知变异的信息，如单核苷酸变异和小插入缺失。自作为TopHat2的继任者推出以来，HISAT2因其速度、准确性和相对较低的内存使用量而被广泛采用。
STAR（剪接转录本比对到参考）是另一种广泛使用的RNA-seq数据剪接感知比对器，以其高速度和高灵敏度而闻名。STAR比对算法（Dobin et al., 2013）包括种子搜索阶段，然后是候选比对的聚类、缝合和评分。该算法通过映射种子序列并在候选连接上延伸来识别剪接连接。STAR的一个重要优势是能够在不需要专门已知连接数据库的情况下识别剪接连接。STAR使用基于后缀数组的索引策略来促进测序读段到参考基因组的快速映射。该算法还可以通过其读段延伸程序识别错配和插入或缺失，从而提高在存在测序错误或基因组变异时的比对灵敏度。
Burrows-Wheeler比对器（BWA）是一套用于将测序读段映射到参考序列的算法。虽然BWA主要用于基因组DNA测序，但也可应用于转录组数据（即短读段）。BWA-MEME（Jung and Han, 2022）是BWA-MEM（Li, 2013）的继任者，据报道相对于BWA-MEM提高了比对速度和准确性。然而，BWA-MEME不是剪接感知比对器，因此不专门识别剪接连接或重建转录本异构体。因此，它最适合在不需要剪接感知基因组比对的情况下，直接将读段比对到从头转录组组装的应用。Bowtie2将Burrows-Wheeler变换和FM索引框架与灵活的比对策略相结合，提供快速灵敏的短读段比对（Langmead and Salzberg, 2012）。与BWA一样，Bowtie2可用于将读段直接比对到从头转录组组装。它也被整合到多个转录组分析工作流程中，包括Trinity，因此可用于评估组装转录本的读段支持。对于长读段比对，Minimap2是最广泛使用的比对器之一。它旨在高效地将长测序读段映射到参考基因组或转录组组装，同时保持相对较低的计算需求（Li, 2018）。其速度、内存效率和准确性使其成为Oxford Nanopore和PacBio等平台生成的长读段数据的常用选择（Li, 2018）。
2.8 转录本计数
在差异表达分析之前的一个基本步骤是构建丰度矩阵（或计数矩阵），代表感兴趣基因组特征（如基因或转录本）的表达水平。通常使用两种主要策略：基于比对的方法（依赖于比对到参考基因组或从头转录组组装的读段）和基于无比对或轻量级映射的方法。没有单一工具对所有转录本量化场景都是最优的。通常，提供更高计算效率的工具可能在准确性或灵敏度方面做出不同的权衡，而执行更详细比对或概率建模的方法可能需要更多计算资源。有几种工具广泛用于量化Illumina平台生成的短读段数据，包括Salmon（Patro et al., 2017）、Kallisto（Bray et al., 2016）、RSEM（Li and Dewey, 2011）、StringTie（Pertea et al., 2016）、HTSeq（Anders et al., 2015）和featureCounts（Liao et al., 2014）。对于Nanopore或PacBio平台生成的长读段数据，可以使用Bambu、IsoQuant和Oarfish等工具进行转录本和异构体量化。
在最广泛使用的转录本量化工具中，Salmon主要被认为是转录本水平的量化器。它使用轻量级准映射和选择性比对，针对转录组参考来量化读段，而不是需要常规比对到整个基因组。这种策略能够快速量化，同时考虑片段长度、序列特异性偏差和位置偏差等因素。Salmon包括索引和映射框架，然后是估计表达水平和模型参数的在线和离线推理程序（Patro et al., 2017）。Salmon也可以通过适当的工作流程设置与长读段数据一起使用，包括Oxford Nanopore或PacBio读段的--ont选项。然而，由于Salmon最初主要针对短读段数据开发，其对长读段量化的适用性应根据测序平台和实验设计进行评估。
RSEM是另一种广泛使用的转录本量化工具，并已整合到Trinity工作流程中。由于它可以针对从头转录组组装进行转录本量化，因此在没有参考基因组时特别有用。RSEM使用概率模型估计转录本和基因丰度，并报告几种常用度量，包括TPM（每百万转录本）。TPM考虑了转录本长度和测序深度，样本内TPM值之和为1×10
6。与RPKM或FPKM不同，TPM归一化首先考虑转录本长度，然后对测序深度进行归一化，便于比较样本间的相对转录本丰度。RSEM还生成期望计数，这些是分数而非整数值计数，代表概率模型分配给基因或异构体的期望片段数。这些估计可用于下游差异表达分析，但应根据统计框架的要求和所使用的特定RSEM输出选择合适的输入。RSEM还可以报告FPKM或RPKM值，这些值根据转录本长度和文库大小对读段或片段计数进行归一化。这些度量保留在某些工作流程中，以与旧分析兼容，但TPM通常更受青睐，用于报告相对转录本丰度。RSEM还促进了RNA-seq量化的测序深度和实验设计的成本效益评估（Li and Dewey, 2011）。
StringTie是一种转录本组装和量化工具，可估计单个生物样本中基因和转录本异构体（剪接变体）的丰度。它报告常用度量，如FPKM和TPM。除了Illumina等平台生成的短读段数据外，StringTie还可以处理PacBio和Oxford Nanopore平台的长读段数据，并支持整合短读段和长读段测序数据的分析。
HTSeq是一个广泛使用的工具包，用于处理和处理先前生成的比对（通常由STAR或HISAT2等比对器产生）的RNA-seq数据。HTSeq-count为单个基因或基因组特征生成原始读段计数，并提供无法分配到特征的读段摘要。这些类别包括：no_feature：比对到不包含注释基因或外显子的基因组区域的读段；ambiguous：比对到两个或多个不同基因重叠区域的读段，无法明确分配到一个基因；too_low_aQual：由于作图质量（MAPQ）低于用户定义的最小阈值而被排除的读段；not_aligned：被比对软件标记为未比对的读段；alignment_not_unique：具有多个报告比对到不同基因组位置的读段。这些读段通常被排除以避免双重计数。featureCounts是另一种广泛使用的读段计数工具。它生成包含分配给每个基因组特征的读段数的计数矩阵，以及报告读段分配统计的摘要文件（Liao et al., 2014）。
对于Nanopore或PacBio平台生成的长读段数据，量化工具的选择取决于参考基因组的可用性、测序技术以及分析涉及模式生物还是非模式生物等因素。Bambu和IsoQuant对于长读段转录本量化特别有用，因为它们在准确性和灵敏度之间具有最佳平衡。Bambu是一个R包，专为长读段转录组分析设计，特别是Oxford Nanopore数据。它可以识别新异构体并将读段分配给转录本模型以进行丰度估计。其统计框架还帮助区分受支持的新转录本与潜在假阳性，这在分析长读段数据时很重要（Chen et al., 2023）。因此，Bambu非常适合需要基因和异构体水平量化的分析。IsoQuant专为从长读段测序数据进行准确灵敏的转录本和异构体量化而设计。它可以处理Oxford Nanopore和PacBio HiFi读段，特别有助于表征转录本结构和选择性剪接。其重建和量化转录本异构体的能力使其适合对转录组结构进行详细分析。Oarfish是一种相对较新的工具，专为使用概率模型进行快速转录本量化而设计。它已证明在PacBio Kinnex数据上具有高效性能，并且可以快速处理大型数据集。因此，Oarfish可能特别适用于计算效率是重要考虑因素的大规模数据集（Jousheghani et al., 2025）。
转录本量化通常可以在基因或转录本水平上进行。基因水平量化涉及聚合分配给基因的转录本或外显子区域的读段或片段，无论其特定剪接模式如何。HTSeq和featureCounts等工具将读段分配给注释的基因组特征（最常见的是外显子），并广泛用于生成差异基因表达分析的基因水平计数。相比之下，转录本水平量化估计由给定基因产生的单个转录本异构体的丰度。Salmon和Kallisto等工具使用最大似然估计来估计转录本丰度，同时考虑与多个异构体兼容的读段。转录本水平量化对于研究选择性剪接和异构体使用变化特别有用。RSEM、Bambu和IsoQuant可以提供基因水平和转录本水平的丰度估计，具体取决于分析和输出配置。
2.9 差异表达分析
差异表达分析的目标是识别丰度在两个或多个实验条件之间显著不同的基因或转录本。该分析是转录组学研究的关键组成部分，因为它可以提供与疾病、治疗反应、环境适应和其他生物过程相关的生物学机制的见解（Beltrán-Hernández et al., 2025; Hernandez-Eligio et al., 2020）。一旦生成丰度或原始计数矩阵，应进行探索性分析以评估样本质量、识别潜在异常值并评估生物学重复的一致性。这些初步分析应在差异表达统计检验之前完成。
差异表达分析通常识别在一个实验条件下相对于参考或对照条件显著更高或更低的基因或转录本。所得的上调和下调基因集随后可进行功能富集分析，以识别与观察到的转录变化相关的生物过程、分子功能、通路或其他功能类别。整体工作流程如图1所示。
图1 转录组工作流程的详细概述。该过程始于对待分析RNA的分类。对于mRNA或总RNA（包括lncRNA），工作流程进行到图表的左侧。如果注释良好的参考基因组可用，则应遵循工作流程A（Flow A）。该工作流程使用Illumina平台（HiSeq 2000、NextSeq 500或MiSeq）上的双端测序，这可以提供成本效益高的测序策略。如果没有参考基因组可用，工作流程的选择取决于密切相关参考基因组的可用性、生物体基因组的复杂性以及可用预算。当没有密切相关的参考基因组可用，或者由于生物体具有大或高度复杂的基因组（如许多植物和哺乳动物的情况）而导致现有参考基因组不合适时，如果资金充足，可以使用工作流程B（Flow B）。该工作流程涉及使用Oxford Nanopore或PacBio技术进行测序。或者，当没有参考基因组可用且生物体具有相对较小且不太复杂的基因组，或财力有限时，可以遵循工作流程C（Flow C）。该工作流程使用Illumina平台上的双端测序。当重点是sRNA时，应遵循工作流程D（Flow D），使用Illumina平台上的单端测序。
2.9.1 探索性数据分析
探索性数据分析是在差异表达检验之前评估RNA-seq实验整体质量的重要步骤。其目标包括识别潜在批次效应、评估生物学重复之间的一致性以及检测异常样本（Tarazona et al., 2015）。探索性分析使用先前生成的丰度矩阵或原始计数进行。根据下游分析，计数数据通常在进行可视化之前进行归一化和转换。常用方法包括对数转换、方差稳定转换（VST）和正则化对数转换（rlog）（Love et al., 2014）。
PCA和MDS是可视化样本间关系和评估实验条件之间分离的最常用方法之一。如上所述，这些分析通常使用归一化和转换后的表达值进行，通常关注最具变异性的基因而非全部基因。箱线图可用于评估样本间表达值的分布，而带有层次聚类的热图可以帮助确定来自相同实验条件的样本是否表现出相似的基因表达谱。
RNA-seq DGE分析中一个重要但有时被忽视的预处理步骤是在统计检验之前过滤低表达基因。计数非常低的基因为差异表达分析提供的信息有限，并且可能不成比例地贡献于离散度和模型不确定性（Giwa et al., 2026）。因此，在差异表达分析之前检查样本间的每百万计数（CPM）并利用该信息建立适当的过滤标准是有用的。edgeR、NOISeq和DESeq2等包为过滤低计数基因提供了内置方法。适当的过滤可以减少无信息特征的影响，并提高下游分析的效率和统计功效。总体而言，探索性分析有助于在差异表达检验之前识别技术问题并评估数据质量。
2.9.2 差异表达分析方法
已经开发了多种统计方法用于差异表达分析（Costa-Silva et al., 2023）。在最广泛使用的方法中，DESeq2和edgeR使用负二项模型来解释RNA-seq计数数据中的生物学变异和过度离散。limma框架与voom转换结合时，在对数转换表达值的均值-方差关系建模后使用线性模型。这些方法在RNA-seq分析中已广泛确立，因为它们为建模生物学变异提供了稳健的统计框架，并且可以适应各种实验设计，包括生物学重复数量相对较少的研究（Love et al., 2014; Robinson et al., 2010）。最近的综述同样将DESeq2、edgeR和limma确定为RNA-seq差异表达分析中最常用的方法（Costa-Silva et al., 2023）。
DESeq2和edgeR可以广义地归类为参数方法，因为它们为计数数据指定概率分布并从观测数据中估计模型参数（包括离散度）。这些方法特别适用于具有生物学重复的实验，因为重复数据对于估计生物学变异至关重要。相比之下，NOISeq（Tarazona et al., 2011）等非参数方法不依赖于观察计数的预定义参数分布。相反，NOISeq从数据或通过模拟估计技术和生物学噪声的经验分布，并利用该信息评估差异表达的概率。这些方法在某些实验条件下可能有用，特别是当分布假设难以满足时。然而，无论使用何种差异表达方法，缺乏生物学重复都会显著限制统计推断的可靠性。
2.9.2.1 DESeq2
DESeq2使用基于负二项分布的统计模型来分析RNA-seq计数数据。该框架解释了转录组计数数据特有的生物学变异和过度离散。该方法结合了基于大小因子的归一化，估计基因特异性离散度，随后执行统计检验以识别DEG。使用错误发现率（FDR）对p值进行多重检验校正，为识别统计显著的差异表达提供了受控框架（Love et al., 2014）。DESeq2还允许在结果提取期间预过滤低计数基因，这可以通过排除信息不足的基因来提高统计功效。也可以在模型拟合之前预过滤低计数基因以减少计算需求。简单的过滤阈值（如指定数量样本中的最小计数10）可作为实际起点，但过滤标准应适应实验设计和文库大小（Love et al., 2014）。
2.9.2.2 edgeR
edgeR是另一种广泛使用的基于负二项模型的RNA-seq计数数据差异表达包。edgeR的一个关键特征是其经验贝叶斯离散度估计方法，该方法允许跨基因共享信息，并且可以在生物学重复相对较少的实验中改进方差估计。edgeR还整合了考虑文库间RNA组成差异的归一化方法，并提供了适用于各种实验设计的统计检验。edgeR保留在最少数量样本中具有足够高计数的基因。在统计检验之前，edgeR可以使用filterByExpr()函数过滤掉表达不足的基因（Robinson et al., 2010; McCarthy et al., 2012; Anders et al., 2013）。该函数根据文库大小和实验设计确定适当的过滤阈值，从而保留在适当数量样本中具有足够表达的基因。此过滤步骤减少了低信息基因对下游分析的影响。
2.9.2.3 NOISeq
NOISeq是一种用于RNA-seq数据差异表达分析的非参数方法。与基于预定义计数分布的方法不同，NOISeq不假设观测数据具有特定参数分布。相反，它从数据或通过模拟经验地估计噪声分布。通过比较条件间的表达水平，同时考虑观察到的变化幅度和数据中的变异性来评估差异表达（Tarazona et al., 2011）。NOISeq提供了几种过滤选项，包括CPM、Wilcoxon和Proportion，可以使用filtered.counts()函数实现。
2.9.2.4 Limma
limma（微阵列数据线性模型）包最初为微阵列数据开发，已通过voom转换成功适应RNA-seq分析。与DESeq2和edgeR直接使用负二项分布建模计数数据不同，limma-voom使用转换表达值上的线性模型。voom方法将计数转换为每百万对数计数（log-CPM），估计均值-方差关系，并为单个观测分配精度权重。这些权重允许线性建模框架解释RNA-seq数据中均值依赖方差的特点。limma-voom计算效率高，可以适应复杂的实验设计，使其特别适用于涉及较大样本量或多因素实验设计的研究（Ritchie et al., 2015）。
差异表达分析最终产生一组丰度在实验条件间显著不同的基因或转录本。然而，识别统计显著变化只是解释转录组数据的第一步。下一步是通过功能富集和通路分析确定这些变化的生物学意义。
2.10 生物学解释
在识别DEG后，下一步是通过功能富集分析解释其生物学意义。这种方法评估特定生物过程、分子功能、细胞组分或代谢通路是否在感兴趣的基因中显著过表达。功能富集分析在转录组研究中尤为重要，因为这些实验通常识别大量DEG，使得难以解释其个体生物学意义。富集方法不是独立分析每个基因，而是识别与特定细胞功能、生物过程或分子通路相关的协调模式。
用于此目的的最常用注释数据库包括Gene Ontology（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）和直系同源簇（COG）。GO将基因产物分为三个主要类别：生物过程、分子功能和细胞组分。KEGG将基因和基因产物组织到代谢通路、信号通路和其他功能网络中。COG是NCBI数据库，基于直系同源性（指源自共同祖先基因并在物种形成后分化的基因）将来自完整基因组（特别是细菌和古菌）的蛋白质分为功能组。
功能富集分析可以根据底层算法和输入数据的处理方式大致分为三类：
单基因富集分析（SEA）/过表达分析（ORA）：该方法评估特定功能术语在预定义基因列表中相对于参考背景集是否统计上过表达。基因列表通常使用统计阈值（如指定的p值或校正p值）定义（García-Moreno et al., 2022; Huang et al., 2009b; Wijesooriya et al., 2022; Xu et al., 2024）。统计显著性通常使用超几何分布或Fisher精确检验进行评估（Huang et al., 2009b; Hosack et al., 2003; Draghici et al., 2003）。
基因集富集分析（GSEA）/功能类别评分（FCS）：该方法整体分析转录组数据集，无需对单个基因进行预定义显著性阈值。基因根据生物学或统计标准进行排序，该方法评估预定义基因集是否富集在排序列表的顶部或底部。因此，这种方法可以检测涉及单个基因表达变化相对较小的协调变化（García-Moreno et al., 2022; Huang et al., 2009b; Subramanian et al., 2005; Xie et al., 2011）。
模块富集分析（MEA）：该方法整合功能注释或生物学网络之间的关系，以识别相关术语组。通过考虑注释之间的相互作用，MEA有助于识别生物学模块，而不是将功能术语视为独立实体（García-Moreno et al., 2022; Huang et al., 2009b）。
目前有几种计算工具可用于功能富集分析。最广泛使用的是DAVID（Dennis et al., 2003; Huang et al., 2009a）和GSEA（基因集富集分析）软件包（Subramanian et al., 2005; Liberzon et al., 2011; Wijesooriya et al., 2022）。其他广泛使用的工具包括g:Profiler（Reimand et al., 2007; Kolberg et al., 2023）、PANTHER（Mi et al., 2013; Mi et al., 2019）、KOBAS（Wu et al., 2006; Xie et al., 2011; Bu et al., 2021）和WebGestalt（Zhang et al., 2005; Elizarraras et al., 2024）。topGO包（Alexa and Rahnenführer, 2009; 2010）是另一种广泛使用的工具，它在富集分析期间考虑GO术语的层次结构，从而减少相关术语之间依赖性的潜在影响。最后，GREAT（McLean et al., 2010）广泛用于基因组区域的功能解释，通过将非编码基因组区域与附近或功能相关的基因和生物学注释相关联（Chicco and Jurman, 2022）。
3 FAIR原则
现代转录组工作流程中的一个关键考虑因素是符合FAIR原则：可查找、可访问、可互操作和可重用（Wilkinson et al., 2016）。这一考虑尤为重要，因为RNA测序数据复杂且生成成本高，并可能受到显著技术变异的影响。确保测序数据、相关元数据和分析工作流程符合FAIR原则可促进科学可重复性，并最大化研究数据的长期价值。数据可追溯性要求在整个分析工作流程中对输入文件、转录本、基因和数据集使用唯一且持久的标识符。示例包括GEO或BioProject登录号以及稳定的基因或转录本标识符，而非仅使用基因名称。此类标识符有助于检索原始测序数据（包括FASTQ文件），并使研究人员能够追溯数据的来源和处理历史。全面的元数据对于通过索引搜索促进数据发现也至关重要，应包括实验条件、样本特征、测序程序和分析工作流程的详细描述。可访问性要求将测序数据和相关文件存放在提供长期存储和标准化访问的公共存储库中。示例包括NCBI Sequence Read Archive（SRA）、欧洲核苷酸档案库（ENA）和日本DNA数据库（DDBJ）。在适当时，处理后的数据（如基因和转录本水平的量化矩阵）也应通过存储库或补充资源以标准化和可访问的格式提供。提供这些数据减少了数据检索的技术障碍，并促进了独立分析和验证。可互操作性取决于使用标准化的数据格式和受控词汇表。BAM、GTF/GFF3和CSV等格式促进与广泛生物信息学软件和编程环境（包括R、Python和命令行工具）的兼容性。使用标准化本体和受控词汇表（如GO）对于一致描述表型、细胞类型、生物过程、细胞组分和分子功能也很重要。这些实践减少了术语歧义，并促进了跨生物数据库和分析平台的信息整合。可重用性要求对数据来源、分析代码、输入和输出文件、软件版本、参数设置、参考基因组和适用使用许可进行全面文档记录。例如，应明确报告软件版本（如Bambu v3.0和IsoQuant v3.3）以及每次分析使用的参数值。还应指定参考基因组组装和注释版本，以便其他研究人员重现分析工作流程并将其产生的数据集与其他研究整合。因此，FAIR原则在整个转录组工作流程中都有影响，从输入文件的验证到新转录本的识别和验证、基因和转录本水平表达矩阵的生成，以及以GTF/GFF3或CSV等标准化格式发布处理结果。这些实践促进了其他实验室和研究小组对数据的独立验证和重用。通过保留执行分析的计算环境可以进一步加强可重复性。容器化和环境管理工具（如Docker和Conda）可以帮助保留软件依赖关系和版本，从而提高从转录本量化、异构体识别和功能富集分析获得的定量结果的可重复性。
4 结论
转录组分析工作流程可以根据生物学、计算和经济考虑遵循多种途径。关键生物学因素包括参考基因组或系统发育相关生物体注释充分的基因组的可用性，以及所分析RNA的类型，包括总RNA、lncRNA和sRNA。计算能力和对专门基础设施的访问也影响适当分析策略的选择。仔细选择实验和生物信息学策略，包括生物学重复数量、质量控制程序以及转录组组装、读段比对和差异表达分析的方法，对于获得稳健且生物学可靠的结果以支持下游分析至关重要。最合适的工作流程取决于所研究生物体的生物学特征、参考基因组和注释的可用性和质量、计算资源以及分配给研究的预算。
尽管高质量参考基因组的可用性不断增加，但使用RNA-Bloom2和isONform等工具进行从头转录组组装在现代转录组学中仍然有价值。这种方法对于研究非模式物种特别有用，并且可以促进基因组重排和嵌合转录本的检测，以及新异构体和lncRNA的识别，同时减少对现有注释的依赖。对于长读段测序和无参考转录组分析，Oxford Nanopore和PacBio技术提供了强大的选择。在没有参考基因组且预算受限的情况下进行短读段测序时，Trinity或rnaSPAdes以及混合方法仍然是可用的替代方案。
STAR和HISAT2等比对方法考虑了外显子-内含子结构和选择性剪接，从而支持为下游差异表达分析准确构建丰度矩阵。适当的归一化同样至关重要，应根据高通量测序数据的特征和分布进行调整，以最小化后续分析中的偏差。
在许多实验环境中，当有足够的生物学重复时，DESeq2和edgeR等差异表达分析方法可以提供可靠的结果。虽然NOISeq等方法在生物学重复数量有限时可能有用，但减少重复通常会降低统计功效，并可能增加差异表达估计的不确定性。因此，从重复有限的数据集得出的结论应谨慎解释。
对实验和对照条件之间不同的基因或基因组区域进行功能富集分析，有助于解释RNA-seq数据背后的生物学背景。通过将基因表达变化与生物过程、分子功能、细胞组分和通路联系起来，这些分析提供了对与转录变化相关的生物学机制的更广泛理解。
生物信息学的持续扩展也导致了新工具和分析流程的开发，这些工具和流程越来越多地为没有大规模数据分析、高性能计算或命令行界面（CLI）应用广泛专业知识的用户所使用。这类发展在符合FAIR原则的情况下实施，可以减少转录组分析的技术障碍。作为对这一努力的贡献，研究人员开发了IDEAMEX（Jimenez et al., 2019），这是一个基于网络的平台，旨在促进从丰度矩阵进行转录组分析。该平台支持使用四种方法进行探索性数据分析和差异表达分析：DESeq2、edgeR、limma和NOISeq。整合这些方法生成的结果可以为识别稳健的差异表达模式提供补充证据，并选择数据集进行后续功能富集分析。因此，IDEAMEX的价值不仅限于促进数据处理，还在于改善计算资源有限社区对生物信息学资源的访问。
生物信息学的民主化不仅限于分析算法的可用性，还需要努力减少参与的技术、基础设施和社会障碍。转录组工作流程的复杂性以及对专门计算基础设施的需求是关键的障碍，对科学领域的女性以及资源受限环境中的研究人员影响尤为严重。在此背景下，IDEAMEX不仅作为技术资源呈现，而且作为为没有高级编程专业知识的用户提高转录组分析可及性的一种手段。结合FAIR原则的采用，此类资源可以为更开放、可重复和包容的基因组知识获取做出贡献，无论可用的计算基础设施或财务资源如何。
