基于单细胞空间转录组学的乳腺癌抗体药物偶联物靶点细胞分辨率定位图谱

《Translational Oncology》：Cell-resolved spatial mapping of antibody-drug conjugate targets in breast cancer

抗体药物偶联物（ADC）靶点的组织水平丰度不足以指导治疗决策，靶点还必须定位于相关细胞。本研究利用空间转录组学技术，在单细胞分辨率下绘制了11种临床相关ADC靶点在乳腺癌中的表达图谱。研究人员分析了公开的CosMx全转录组乳腺癌标本（约154,816个细胞），将细胞分为七个谱系，并检测了ERBB2（HER2）、TACSTD2（TROP2）、ERBB3（HER3）、NECTIN4、FOLR1（FRα）、CEACAM5（CEA）、CD276（B7-H3）、MUC1、MET、EGFR和FOLH1（PSMA）的表达模式。结果显示，MUC1、HER2、NECTIN4、TROP2和HER3富集于肿瘤上皮，而B7-H3主要在血管内皮和肌上皮细胞中高表达，PSMA则集中于内皮细胞。在TCGA-BRCA的1,097例肿瘤与114例正常组织的比较中，B7-H3在肿瘤组织中上调，但其空间信号主要来自非恶性间质成分。两种Xenium验证标本中，HER2和TROP2的肿瘤上皮富集模式得到重现，而EGFR在肌上皮细胞中表达更高。研究表明，空间分辨的转录组分析能够区分ADC靶点的细胞来源，揭示单纯依靠组织平均测量可能掩盖的靶点异质性，并为后续蛋白层面的验证和临床相关性研究提供假设基础。

研究背景与科学问题

乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤，抗体药物偶联物（ADC）已成为其核心治疗手段。ADC通过靶向特异性抗体将细胞毒性载荷递送至肿瘤细胞，但疗效与安全性高度依赖于靶抗原在肿瘤细胞而非正常组织上的选择性表达。传统组织平均检测方法（如批量RNA测序或免疫组化）无法区分靶点信号的细胞来源——一个靶点在肿瘤组织中总体高表达，可能实际上主要来源于间质、血管或免疫细胞，而非恶性上皮细胞。这种细胞来源的混淆可能导致对ADC治疗窗的错误估计，增加脱靶毒性风险。因此，亟需一种能够在完整组织原位、单细胞精度下同时解析多种ADC靶点在不同细胞谱系中分布的方法。

研究内容与主要发现

研究人员利用公共CosMx全转录组空间成像平台的一个乳腺癌标本（约645,000个细胞经随机抽滤后保留154,816个细胞），结合Seurat聚类与七类细胞谱系注释（肿瘤上皮、成纤维/间质、髓系、B/浆细胞、T细胞、肌上皮、内皮），系统分析了11种临床ADC靶点的RNA表达空间图谱。主要发现包括：

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  靶点呈现两类分布模式：MUC1、HER2（ERBB2）、NECTIN4、TROP2（TACSTD2）和HER3（ERBB3）显著富集于肿瘤上皮细胞，其在非恶性细胞中的平均表达量低于0.14。
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  相反，B7-H3（CD276）在内皮细胞和肌上皮细胞中最高，PSMA（FOLH1）集中表达于内皮细胞，而肿瘤细胞中这两者的表达水平很低。
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  在TCGA-BRCA批量转录组数据（1,097肿瘤 vs 114正常组织）中，B7-H3在肿瘤组织中上调，但空间数据表明其信号主要来自血管内皮和间质，而非肿瘤细胞本身——这一对比凸显了批量分析的局限性。
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  两个独立的Xenium空间转录组验证标本中，HER2和TROP2的肿瘤上皮富集模式得到跨平台重复，而EGFR则在肌上皮细胞中表达更高，提示并非所有ADC靶点均优先定位于肿瘤细胞。
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  生存分析未发现任何单一靶点基因与总生存期有稳健的独立预后关联。

关键技术方法

1. 1.
   CosMx全转录组空间分子成像：对一个福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）乳腺癌标本进行原位单细胞转录组捕获，获得约645,000个细胞的基因表达矩阵，经随机抽滤保留154,816个高质量细胞进行分析。
2. 2.
   无监督聚类与谱系注释：采用Seurat v5.5.1进行Louvain聚类（分辨率0.5），基于已知标志基因模块评分将15个簇归入七个细胞谱系（肿瘤上皮、成纤维/间质、髓系、B/浆细胞、T细胞、肌上皮、内皮）。
3. 3.
   邻域分析与转录本溢出对照：构建k近邻图（k=10），计算目标细胞周围肿瘤上皮邻居的比例，以排除B7-H3和PSMA在非肿瘤细胞中的富集是由于相邻肿瘤细胞的转录本扩散所致。
4. 4.
   跨平台验证：在两个公共Xenium乳腺癌标本（一个浸润性导管癌标本和一个乳腺癌参考块）中，使用靶向基因面板验证ERBB2、TACSTD2、MUC1和EGFR的细胞分布模式。
5. 5.
   批量转录组背景化：从UCSC Xena数据库获取TCGA-BRCA的1,097例原发肿瘤和114例正常组织的表达数据，进行肿瘤-正常差异比较和Cox比例风险生存分析。

研究结果详解

一、七谱系单细胞空间图谱的建立

无监督聚类产生15个簇并被成功注释为七个细胞类型。肿瘤上皮为最大群体（61.9%），其次为成纤维/间质（10.3%）和髓系细胞（10.3%）。各谱系的空间分布呈现清晰的区域分隔：肿瘤上皮形成连续片状和腺体结构，间质和免疫细胞分布于周边。每类细胞的前五位阳性标志基因与其谱系身份高度吻合（如肿瘤上皮的PIP、SERHL2、MLPH；间质的COL1A1、LUM、POSTN；内皮的EGFL7、PLVAP、FLT1）。

二、ADC靶点的肿瘤富集与微环境富集模式

11种靶点呈现两大分布模式。第一类（MUC1、HER2、NECTIN4、TROP2、HER3）在肿瘤上皮中平均表达量和检出率均为最高，非恶性细胞中表达极低。空间热图显示HER2和TROP2信号与肿瘤上皮区域高度重叠。第二类（B7-H3、PSMA）则富集于非肿瘤细胞：B7-H3在内皮（均值0.35）和肌上皮（0.31）中最高，PSMA集中于内皮（0.47），而肿瘤细胞中PSMA均值仅为0.05。FOLR1和CEACAM5在所有细胞类型中均保持低表达（≤0.10）。

三、平台间单靶点检出率的差异

在CosMx全转录组标本中，60%的肿瘤细胞ERBB2计数为零，68%的TACSTD2计数为零；而在靶向313基因的Xenium标本中，对应比例分别降至3.5%和11%。由于标本不同、化学原理和面板规模各异，此差异不能单独归因于平台设计，但警示零计数不等于靶点真正缺失。

四、受体表型与空间组织特征

肿瘤细胞的RNA受体表型分析显示ERBB2表达相对较高（均值0.68，检出率36.6%），而ESR1和PGR较低，提示该标本倾向于HER2富集或激素受体阴性表型。邻域分析证实肿瘤上皮具有强烈的自我聚集倾向（z=507），与非恶性细胞呈负相关，其中与髓系细胞（z=-308）和成纤维细胞（z=-294）的排斥最明显。亚采样敏感性分析显示两半数据的细胞类型平均靶点表达矩阵几乎完全一致（Pearson r=0.998）。

五、Xenium标本中的跨标本验证

在两个额外Xenium标本中，肿瘤上皮始终是HER2和TROP2检出率和平均表达量最高的细胞类型。例如在浸润性导管癌标本中，TROP2在84%的肿瘤细胞中被检出，而在非肿瘤细胞中仅为26%。MUC1也呈现相同模式。EGFR则相反，在两个Xenium标本中均在肌上皮细胞中表达最高，表明并非所有ADC靶点都局限于肿瘤细胞。

六、TCGA-BRCA批量肿瘤-正常表达对比

在1,097例肿瘤与114例正常组织的比较中，六个靶点在肿瘤中上调：CEACAM5（log2倍变化+4.1）、MUC1（+2.1）、CD276（+0.85）、ERBB3（+0.85）、NECTIN4（+0.75）和ERBB2（+0.54）。四个靶点在肿瘤中下调：FOLR1（-3.8）、EGFR（-3.5）、MET（-2.4）和FOLH1（-1.6）。TACSTD2无显著差异。B7-H3的案例尤为典型：它在批量肿瘤中上调，但空间数据却显示其主要由内皮、肌上皮和间质细胞贡献——这清晰展示了批量分析无法识别细胞来源的固有局限。

七、总生存期关联分析

在1,080例患者中，未有任何ADC靶点的单变量或多变量关联在校正多重检验后达到统计学显著性。最低名义P值见于NECTIN4（连续Cox模型P=0.040；中位分割log-rank检验P=0.053），但在调整年龄、病理分期和PAM50亚型后，所有靶点的风险比均不显著（校正后P值>0.05）。这表明这些靶点的RNA表达水平在本队列中不具备独立的预后价值。

讨论与结论总结

讨论部分强调，本研究在RNA层面将11种ADC靶点分为肿瘤上皮富集型和基质/血管富集型两类，但RNA信号并不等同于表面蛋白丰度或临床治疗窗。以PSMA为例，虽然在其研究中20%的内皮细胞检出FOLH1转录本，但既往定量免疫组化研究显示仅少数乳腺癌新生血管存在PSMA蛋白染色，质疑了PSMA导向诊疗在该疾病中的可行性。B7-H3在批量肿瘤中上调但在空间上主要来自非恶性细胞，这并非矛盾，而是反映了组织组成对批量对比的影响。研究人员指出，将这类转录组图谱转化为临床决策必须经过蛋白水平验证、多患者队列确认以及与ADC疗效和毒性的直接相关性分析。具体建议路径包括：首先在匹配组织切片上进行多重免疫荧光或成像质谱流式，重现细胞分配并检测ADC所结合的胞外域蛋白；随后在同一切片上实现RNA与蛋白共检测；最后在ADC治疗队列中将区室化的蛋白评分与客观缓解和无进展生存期相关联。

结论部分翻译如下：单细胞空间转录组学将富集于肿瘤上皮的ADC靶点与表达于间质和血管细胞的靶点区分开来。HER2和TROP2在所分析的三个标本中展现出最一致的肿瘤富集模式，而EGFR则不然。这些RNA层面的发现应为蛋白水平的多患者验证研究设计提供依据，但不能替代对表面抗原或ADC活性的直接测量。在将这些观察结果应用于临床之前，必须完成区室分辨的蛋白确认，随后在治疗队列中将其与ADC反应和毒性进行相关性分析。