基于巴比妥酸红色荧光探针检测生物胺以实现鸡肉腐败智能监测与微生物生长关联分析

《Sustainable Food Technology》：Biogenic amine-sensitive red emitters for smart detection of chicken spoilage linked to microbial growthOpen Access

　　

生物胺（Biogenic amines, BAs）是食品腐败的关键生物标志物，对其进行及时检测对于确保食品质量与安全至关重要。本研究设计并合成了一系列易于获取的基于巴比妥酸（barbituric acid, BBA）的荧光团（AnBA、PhBA、MeOBA和TBTA），通过在蒽核心的第10位进行不同取代基修饰实现结构调控。研究人员随后考察了这些荧光团在溶液相和蒸气相对生物胺的检测性能。在所研究的探针中，TBTA对目标生物胺表现出最佳的传感性能，呈现出从红色到绿色的显著比率荧光位移，检测限达纳摩尔级别（17–47 nM）。在蒸气相中，AnBA和TBTA表现出显著的发射位移（99–161 nm），而PhBA和MeOBA对选定的挥发性胺呈现荧光开启响应。研究人员利用TBTA包被的Whatman试纸条评估了该探针在鸡肉/虾腐败监测中的实际应用可行性。该探针在暴露于腐败过程中释放的生物胺后表现出明显的荧光变化，且该变化与微生物负荷的增加直接相关。因此，利用基于巴比妥酸的荧光探针建立肉类腐败过程中可见光学响应与细菌生长之间的直接关联具有重要意义。上述发现凸显了TBTA作为一种低成本、快速且无需仪器的平台，在肉类新鲜度实时定性评估及食品腐败监测方面的应用潜力。

一、研究背景与科学问题

食品腐败监测一直是食品安全与质量控制领域的重大挑战，尤其在肉类和鱼类等富含蛋白质的易腐食品中，微生物活动会在储存期间降解营养成分。肉类腐败的早期检测能够及时采取措施，防止耐抗菌药物的ESKAPE病原体（包括肠球菌属、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属）通过食物链传播，从而提升食品安全水平，同时有助于减少食物浪费、经济损失、食源性感染以及在“同一健康”框架内抗菌药物耐药性的扩散。

食品腐败的关键化学标志之一是生物胺（Biogenic amines, BAs）的形成，这类物质由微生物对氨基酸的脱羧作用产生。腐胺和尸胺等挥发性生物胺通常在蛋白质类食品分解过程中生成，被广泛视为食品新鲜度的可靠指标。这些胺类的过度积累不仅反映微生物生长状况，还可能对消费者健康构成风险。因此，开发快速、可靠的食品腐败胺检测方法对于食品新鲜度监测和公共安全保障具有重要意义。

传统上，大量昂贵的色谱-质谱联用技术（如HPLC/LC-MS）被用于胺类检测，而荧光（FL）传感方法则主要依赖特定的化学反应。然而，许多现有体系存在固有局限性，包括荧光响应主要局限于溶液态、稳定性和探针效率有限、对多种生物胺的选择性和灵敏度不足等。此外，这些探针的合成往往复杂且具有挑战性，检测时间长、溶解性问题进一步限制了其实际应用。更重要的是，这些局限性给食品腐败的实时监测带来困难，部分体系中微弱或不明显的颜色对比使目视检测变得困难。

在各类荧光探针分子骨架中，巴比妥酸（BBA）基分子因其强吸电子性质、扩展的π共轭体系以及可调的光物理特性而受到广泛关注。这些特征有利于高效的电荷转移相互作用，使BBA连接体成为开发功能材料和分子传感器的多功能构建单元。然而，BBA基探针用于胺传感的潜力此前仅得到有限探索，已有研究多局限于特定种类的单胺和二胺，检测限和颜色变化不够理想。尽管已有显著进展，BBA连接荧光探针用于食品腐败相关生物胺检测的应用在很大程度上仍未被探索，尤其是在将光学响应与微生物生长直接关联的体系中。

二、研究内容与主要发现

针对上述问题，研究人员设计并合成了四种基于巴比妥酸的荧光团（AnBA、PhBA、MeOBA和TBTA），通过在蒽核心第10位引入不同取代基（未取代、苯酚取代、苯甲醚连接和噻吩连接）来调控分子结构。这些探针可作为Michael受体，适合胺类（Michael供体）的亲核攻击。所有四种化合物均呈可见红色，热稳定性可达200 °C。

在溶液态检测中，TBTA（10 μM于1,4-二氧六环）对多种脂肪族二胺/多胺和部分芳香胺表现出快速响应，包括1,3-二氨基丙烷（1,3-DAP）、腐胺（PUT）、尸胺（CAD）、1,6-二氨基己烷（1,6-DAH）、亚精胺、2-苯乙胺和色胺。加入这些胺后，TBTA的发射从亮红色（λ_max ～ 612 nm）瞬时转变为绿色（λ_max ～ 500 nm），产生112 nm的显著蓝移并伴随荧光强度明显增强。而苯胺、三乙胺、N-乙基二异丙胺（DIPEA）和氨等简单单胺则未引起明显光学性质变化。干扰研究表明，其他胺类对腐胺的响应无显著干扰。通过荧光滴定实验，研究人员计算了各分析物的检测限（LOD，采用3.3σ/k计算）：1,3-二氨基丙烷为43.62 nM，腐胺为17.02 nM，尸胺为42.55 nM，1,6-二氨基己烷为23.69 nM，亚精胺为46.53 nM，色胺为23.60 nM，其中对腐胺的灵敏度最高。

在蒸气相检测中，TBTA薄膜对大多数生物胺在10分钟内即表现出从红色到绿色的优异发射颜色变化，但对氨和DIPEA无响应。其中对腐胺蒸气表现出154 nm的显著蓝移，绝对量子产率（Φ_f）提高至3.9%。AnBA和TBTA的发射位移范围为99–161 nm，而PhBA和MeOBA对乙二胺（EDA）、1,3-DAP、腐胺和正丁胺蒸气呈现荧光开启响应。所有探针对伯胺表现出高选择性，对仲胺（二乙胺）和叔胺（DIPEA）无响应。

浓度变化研究表明，随着胺浓度增加，TBTA薄膜从红色（λ_max = 658 nm）逐渐蓝移至绿色（λ_max = 521 nm），蓝移达137 nm，量子产率提高4.3倍。AnBA在腐胺蒸气作用下从红色（λ_max = 618 nm）蓝移至黄色（λ_max = 468 nm），位移达150 nm。PhBA和MeOBA则分别对腐胺和1,3-DAP蒸气表现出开启型黄色发射响应。响应时间测定显示，TBTA完全从红色转变为绿色需8分钟，AnBA从红色完全转变为黄色需约15分钟。

三、识别机制研究

通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、核磁共振氢谱（¹H-NMR）和液相色谱-质谱联用（LC-MS/HR-MS）综合分析，研究人员阐明了探针与生物胺之间的相互作用机制。FT-IR光谱显示新出现的～1677–1690 cm^?1峰表明C=N键的形成，同时1736–1746 cm^?1处强C=O伸缩峰消失，提示BBA单元的断裂。HRMS/LC-MS分析确认了新产物的形成，如AnBA-PUT（m/z 277.1704）、PhBA-PUT（m/z 369.1971）、TBTA-PUT（m/z 461.3）和MeOBA-1,3-DAP（m/z 369.1968）。¹H-NMR滴定实验显示，加入腐胺后TBTA的酰胺NH质子峰（δ 11.41和δ 11.28）完全消失，进一步证实BBA单元的裂解。综合以上证据，传感机制涉及通过aza-Michael加成形成C=N键，随后通过逆Knoevenagel反应裂解BBA单元。

四、稳定性与理论计算

光稳定性研究表明，TBTA和AnBA在连续紫外照射1小时后发射强度几乎不变，表现出优异的光稳定性。两种探针对湿气也表现出良好稳定性。在酸性和碱性条件下，碱性环境会导致巴比妥酸部分去质子化，引起发射蓝移，而酸性条件（HCl）不引起显著发射变化。

密度泛函理论（DFT/CAM-B3LYP/6-31G(d,p)）和时间依赖密度泛函理论（TD-DFT/CAM-B3LYP/6-31+G(d,p)）计算在1,4-二氧六环溶剂模型中进行。计算结果成功再现了TBTA与腐胺相互作用后观察到的蓝移现象，与实验光谱响应一致。

五、实际样品应用

研究人员将TBTA滴涂于Whatman滤纸上作为智能标签，用于监测虾和鸡肉的新鲜度。在密封玻璃罐中，探针包被的滤纸条固定于含虾/鸡肉样品的容器内。在365 nm紫外灯下观察到明显的发射颜色变化：鸡肉样品在26小时后呈现绿色，虾样品保持黄色；虾样品在7小时内从红色变为黄色。鸡肉样品表现出更显著的荧光响应，向绿色方向的位移比虾样品的黄色发射更为明显。

六、微生物负荷直接关联

为建立光学响应与细菌生长的直接关联，研究人员在鸡肉样品腐败过程中（0–48小时）监测TBTA包被试纸条的荧光颜色变化（从红色经黄色最终变为绿色），并在各颜色转变节点采集鸡肉样品进行微生物分析。菌落形成单位（CFU）计数显示，微生物负荷从0小时的约5.9 log₁₀ CFU g^?1显著增加至24小时的约9.3–10 log₁₀ CFU g^?1，48小时保持在约10 log₁₀ CFU g^?1（单因素方差分析，p < 0.001）。48小时后形成细菌菌苔，计数为不可数（TNTC；>1×10¹⁰ CFU）。显色琼脂平板分析表明，腐败鸡肉样品中存在多种细菌共存，包括铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌，这些物种均为文献中常报道的与禽肉供应链相关的抗菌药物耐药相关微生物。TBTA的荧光颜色变化与CFU计数和微生物组成均表现出直接关联。

七、结论与意义

TBTA作为红色发射探针，对所有研究的生物胺表现出广泛响应性，溶液态检测限达纳摩尔级别，呈现从红色到绿色的显著比率响应。蒸气相中，AnBA和TBTA的发射位移为99–161 nm，PhBA和MeOBA对EDA、1,3-DAP、腐胺和正丁胺呈现开启型响应。所有响应均归因于BBA探针与生物胺之间的化学反应形成C=N组分。CFU分析表明肉类腐败导致多胺蒸气释放增加，TBTA滴涂于Whatman纸条上可有效检测这些多胺，实现间接腐败监测。该研究建立了一种经济高效、省时的肉类新鲜度定性评估方法，确立了光学响应与细菌生长之间的直接关系。尽管结果令人鼓舞，但实际应用中仍存在一定局限：由于食品腐败涉及多种生物胺和其他蒸气的混合物，传感器只能提供腐败的总体指示，无法在真实食品样品中识别引起响应的特定胺类。