刺突抗体Fc段与猕猴抵抗SARS-CoV-2攻毒的保护作用相关

《Vaccine》：Spike antibody Fc is associated with protection from SARS-CoV-2 challenge in macaques

摘要

目前尚未正式确立严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的保护相关性指标（CoP）。我们此前报告，中和抗体（NAb）是临床上预防COVID-19感染的有力候选保护相关性指标，而在我们的非人灵长类动物疫苗候选者攻毒试验中，刺突蛋白结合抗体则是病毒载量的最强候选保护相关性指标。在本研究中，我们通过分析刺突蛋白抗体依赖性补体沉积（ADCD）、Fcγ受体结合、同种型及抗体唾液酸化，进一步表征了保护性结合抗体的特征谱。利用机器学习平台SIMON，我们证明ADCD和Fcγ受体结合是临床保护力的有力候选协同相关性指标，因为其加入模型后提升了模型性能。我们发现，FcγR2A结合，紧随其后的是刺突蛋白抗体唾液酸化，是与组织病理学评分负相关性最强的刺突蛋白抗体特征。唾液酸化还与攻毒后6至8天的肺部病毒载量呈负相关。不同免疫程序和性别之间的刺突蛋白抗体ADCD、Fcγ受体结合、同种型和唾液酸化存在显著差异，这表明不同免疫平台所诱导的免疫机制具有异质性。我们得出结论，具有本文所述保护性Fc特征的刺突蛋白结合抗体是一种候选保护相关性指标，既涵盖了严重临床疾病的保护力，也涵盖了高病毒载量的保护力。这些发现应在未来SARS-CoV-2疫苗开发中予以考虑。

引言

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）刺突蛋白抗体在人和动物模型中均仍是衡量疫苗效力的重要指标[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。我们此前在一项涉及90只食蟹猴（RhM）和恒河猴（CyM）的非人灵长类动物（NHP）攻毒模型中，报告了刺突蛋白结合抗体和中和抗体（NAb）的预测能力，这些动物接种了候选DNA疫苗[6]、福尔马林灭活病毒疫苗（FIV）[7]、mRNA疫苗[8]或黑猩猩腺病毒载体（ChAd）疫苗[9]（补充图1，补充表1-3）。采用系统免疫学方法，我们此前的研究发现，NAb是临床保护力（即攻毒后6至8天肺部组织病理学评分较低）的最强预测因子，而刺突蛋白结合抗体则是攻毒后6至8天肺部病毒载量及攻毒后咽部病毒载量的最强预测因子[10]。

然而，抗体既包含抗原结合域（Fab），也包含可结晶片段（Fc）区。Fab介导刺突蛋白结合和中和作用，而Fc区则结合天然细胞上表达的Fcγ受体（FcγR），激活辅助病毒清除的机制。例如，抗体Fc与天然杀伤（NK）细胞上的FcγR3A/CD16相互作用可导致抗体依赖性NK细胞激活（ADNKA）以及穿孔素和颗粒酶的释放；这种效应功能统称为抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。经典（CD14?CD16?）单核细胞上FcγR2A/CD32的激活，以及非经典（CD14?CD16?）和中间型单核细胞（CD14?CD16?）上FcγR3A/CD16的激活，介导抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）作用，即对被调理素化的病原体或病原体感染细胞的吞噬。FcγR2B和FcγR3B受体为抑制性受体，当Fc与之结合时，会抑制上述天然细胞反应。抗体依赖性补体沉积（ADCD）指的是补体沉积在抗体Fc区[11]。抗体Fc结合C1q（补体级联反应中的第一种补体蛋白），该反应最终形成膜攻击复合物（MAC）。MAC通过在病原体和病原体感染细胞膜上形成孔洞来诱导细胞死亡。

Gorman等人证明，在重组NVX-CoV2373临床前研究的24只食蟹猴队列中，上呼吸道和下呼吸道（URT和LRT）病毒载量不仅与刺突蛋白结合和中和作用相关，还与Fc功能相关[12]。鉴于这些发现，我们试图表征我们食蟹猴队列中SARS-CoV-2抗体的Fc结构域。我们想探讨Fc及其效应功能在感染后，或接种DNA、mRNA、灭活病毒和病毒载体疫苗候选平台后有何差异，并借助之前的数据和结果，探讨相对于刺突蛋白结合和中和作用，Fc如何影响临床和病毒保护结局[10]。为了表征Fc，我们对之前研究中相同的90只食蟹猴[10]进行了刺突蛋白抗体同种型和IgG亚类、唾液酸化、Fcγ受体结合和ADCD筛查，使用的血清采集于SARS-CoV-2攻毒当天。

抗体同种型依赖于疫苗平台，且已知与Fcγ受体结合和ADCD相关。在人体中，SARS-CoV-2 mRNA疫苗接种诱导以IgG1为主的反应，其次是IgG3，而IgG2反应较少，IgG4反应在加强免疫后不可检测[13]、[14]、[15]、[16]。然而，在人体中，IgG4滴度会随时间增加，并在反复mRNA疫苗接种或自然SARS-CoV-2感染后得到增强，但在重组蛋白、腺病毒载体或灭活病毒疫苗接种方案后则不会[15]、[17]、[18]。研究发现，IgG4滴度的增加与FcγR2A结合、ADCD和ADCP的降低相关[15]、[17]、[18]。

值得注意的是，食蟹猴的IgG亚类在结构上比其与人类IgG亚类的同源物更为相似，例如食蟹猴IgG1、IgG2和IgG3与人类IgG1最为同源，而非与各自的IgG亚类同源物。猴类IgG亚类之间的相似性及其与人类IgG亚类的差异也意味着，在猴类中IgG2和IgG4的功能沉默程度低于人类，它们以更高的亲和力结合Fcγ受体并更易于激活下游效应功能[19]。因此，进一步证明同种型如何随疫苗平台而变化，以及其与ADCD和攻毒结局的关联，可能有助于我们更深入地了解猴类研究结果向疫苗学更广泛领域的转化性。

虽然FcγR2A结合主要由抗体同种型决定，但证据表明FcγR3A结合也高度依赖于IgG Fc糖基化特征，特别是Fc结构域CH2-CH3界面N297位点的N-连接糖基化。N297核心聚糖是IgG Fc功能的核心，而N297在人类物种内以及人类与猴类之间高度保守[20]。N297聚糖核心的翻译后修饰包括分支末端唾液酸化。在人体中，唾液酸化与FcγR3A结合降低相关，而唾液酸残基的缺失与FcγR3A结合增加相关。唾液酸化还与人体中的ADCD相关，在COVID-19的背景下，N297唾液酸化使ADCD增加3至4倍，并与临床保护力相关[21]、[22]。

激活型FcγR，即FcγR2A和FcγR3A，在人体和猴类之间高度保守，特别是在Fc结合位点[23]、[24]。然而，不同细胞中FcγR表达模式的差异已有报道[23]、[24]、[25]。FcγR2A和FcγR3A在物种间具有交叉反应性，因此猴类FcγR结合测定中使用重组人FcγR[24]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]，本研究亦是如此。尽管如此，在解释结果时仍应考虑种间差异。此外，尽管基于细胞的实验最佳捕获抗体Fc诱导下游细胞效应的效力，但Fcγ受体结合实验现已常用作基于细胞功能实验的替代方法[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]、[40]，由于操作简便且重复性更佳，是定义和测量保护相关性指标（CoP）更为恰当的方法。本文报告的Fcγ受体结果提供了下游效应功能的估计值而非绝对测量值，因为在缺乏可靠的猴类细胞下游功能实验的条件下，无法进行绝对测量。

我们旨在探讨食蟹猴Fc特征是否为SARS-CoV-2攻毒后临床和病毒保护结局的关键预测因子，使用的是我们之前应用的相同的临床前样本和系统免疫学方法[10]。正如补充图1所示且最初在Brady等人文章中所述，90只食蟹猴接受了六种候选疫苗方案之一或攻毒[6]、[7]、[8]、[9]，28天后用高剂量同源SARS-CoV-2（5×10? PFU的Victoria/1/2020，这是一种野生型祖先SARS-CoV-2毒株，与Wuhan-Hu-1毒株密切相关）通过鼻内和气管内途径再攻毒[41]。攻毒后，在急性感染期间，通过定量聚合酶链反应（qPCR）每日测量鼻腔和咽部病毒载量，并计算曲线下面积（AUC）以捕获攻毒后鼻腔和咽部的整体病毒载量。攻毒后6至8天，动物被安乐死，采集肺部进行组织病理学评估和支气管肺泡灌洗（BAL）液的qPCR检测。根据组织病理学评分，动物被分为高或低鼻腔、咽部和肺部病毒载量的二元攻毒后结局组，以及病理或保护组。本方法和补充图12-15以及Brady等人文章[10]中对此有更详细的描述。随后使用名为"Sequential Iterative Modelling Overnight"（SIMON，顺序迭代建模过夜平台）的机器学习平台识别SARS-CoV-2攻毒结局的免疫预测因子[10]。SIMON是一个用于识别最佳建模免疫反应的机器学习平台，此前已用于建模对流感[42]、[43]、脑膜炎球菌[44]、伤寒沙门菌[45]、[46]以及SARS-CoV-2[10]、[47]、[48]的免疫反应。在本研究中，我们使用SIMON评估a）Fc数据的加入如何改变"最佳表现"模型的预测准确性，以及b）与先前识别的SIMON预测因子（刺突蛋白结合抗体和中和抗体滴度）相比，Fc特征预测攻毒结局的强度如何。

章节片段

抗体依赖性补体沉积与临床保护力相关

Brady等人[10]中发现抗刺突蛋白IgM是低肺部病毒载量的最强预测因子，这促使我们分析了ADCD反应，因为短寿命的IgM是经典补体途径最强烈的激活剂[49]。

我们发现ADCD在各疫苗组之间没有显著差异（Dunn多重比较检验）（图1a）。在图1a中，我们还发现ADCD反应在组内不一致。低剂量mRNA疫苗接种的食蟹猴诱导的

讨论

刺突蛋白抗体始终与SARS-CoV-2的预防保护力相关，无论是在临床前模型还是临床研究中[2]、[5]、[54]、[55]、[56]。然而，这种保护力背后的确切机制仍不清楚。仅靠结合或中和刺突蛋白是否足以预防严重COVID-19，还是最优体液免疫还需要Fc介导的效应功能？如果Fc参与确实重要，那么哪种抗体同种型、IgG亚类或

临床前研究设计

90只食蟹猴和恒河猴，年龄2至6岁，被分配接受原发性病毒攻毒、一或两剂疫苗候选者（包括mRNA疫苗、DNA疫苗、福尔马因灭活疫苗或ChAd载体疫苗；见补充表1）或作为未免疫对照组。所有恒河猴均属于未免疫对照组。动物随后接受高剂量SARS-CoV-2攻毒或再攻毒（5×10? PFU的Victoria/1/2020 [41]）

CRediT作者贡献声明

Caolann Brady：写作—审阅与编辑，写作—初稿撰写，方法论，形式化分析，数据整理。Melissa Govender：写作—审阅与编辑，方法论，数据整理。Jack Mellors：写作—审阅与编辑，方法论。Tom Tipton：写作—审阅与编辑，监督，项目管理，方法论。Karen Gooch：写作—审阅与编辑，项目管理。Adriana Tomic：写作—审阅与编辑，监督，方法论，资金获取。Miles W.

资助

本研究由流行病防范创新联盟（CEPI）资助，资助编号H5R01920，授予Miles Carroll教授（M.C.）。资助方未参与或影响论文的构思、数据分析与解释或论文撰写。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Miles Carroll教授报告获得了流行病防范创新联盟（CEPI）的财务支持。如有其他作者，他们声明不存在已知可能影响本研究中报告工作的竞争财务利益或个人关系。

致谢

我们衷心感谢英国健康安全局（UKHSA）在原始非人灵长类样本供应方面的支持及宝贵贡献，感谢Tess Lambe教授及其实验室为优化Fcγ受体实验方法提供了试剂和指导。

本研究由流行病防范创新联盟（CEPI）资助，资助编号H5R01920，授予Miles Carroll教授（M.C.）。资助方未参与或影响论文

Caolann Brady | Melissa Govender | Jack Mellors | Tom Tipton | Karen Gooch | Adriana Tomic | Miles W. Carroll