药物重定位治疗NCOR1相关智力障碍：从单倍剂量不足机制到临床概念验证

《Advanced Science》：Drug Repurposing for Treating NCOR-Related Intellectual Disability

核受体辅抑制因子（NCOR1/2）介导甲基CpG结合蛋白2（MECP2）的转录活性，且NCOR1/2或MECP2的遗传变异与孤独症（autism）或智力障碍（intellectual disability）相关。然而，尚不清楚杂合NCOR突变是否损害认知功能，以及NCOR相关智力障碍如何治疗。研究人员构建了一个携带儿科患者中发现的杂合NCOR1突变（NCOR1 c.2182+2T>G）的基因敲入（knock-in, KI）小鼠品系。这些NCOR1^KI/+小鼠表现出社交回避、刻板行为和记忆缺陷，与杂合NCOR1敲除小鼠相似，证明NCOR1存在单倍剂量不足（haploinsufficiency）。单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）揭示，NCOR1^KI/+小鼠下丘脑γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）能神经元中神经调节蛋白（neuregulins, Nrg1/3）表达上调，而GABA受体亚基Gabra2表达下调。在培养的神经元中，Nrg1过表达足以下调Gabra2。NRG拮抗剂螺内酯（spironolactone）可阻止全长NRG1诱导的Gabra2下调，但不能阻止NRG1胞内结构域（intracellular domain, ICD）诱导的Gabra2下调，提示非经典NRG反向信号（backward signaling）参与NCOR1功能缺失时的Gabra2下调。螺内酯和GABA-A受体正性调节剂别孕烯醇酮（allopregnanolone）均为美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物，可减轻NCOR1^KI/+小鼠的认知损伤。此外，螺内酯改善了一名携带MECP2致病突变的自闭症患者的学习能力。这些发现阐明了NCOR相关认知功能障碍的机制，并为通过药物重定位治疗该疾病提供了临床前概念验证。

《Advanced Science》发表的这项研究聚焦NCOR1相关智力障碍的发病机制与治疗策略，题目为“药物重定位治疗NCOR相关智力障碍”。研究背景方面，孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）是一类复杂的神经发育疾病，约30%患者伴有智力障碍。Rett综合征（Rett syndrome, RTT）是ASD中最严重的类型之一，由甲基CpG结合蛋白2（methyl-CpG-binding protein 2, MECP2）基因突变或拷贝数变异引起。MECP2与核受体辅抑制因子（NCOR1/2）及组蛋白去乙酰化酶3（histone deacetylase 3, HDAC3）形成蛋白复合物，通过改变表观遗传修饰、重塑染色质架构来调控基因转录。已有研究表明，破坏MECP2与NCORs的蛋白相互作用可能是RTT发病的基础。然而，既往动物模型多采用NCOR1/2双基因纯合操作，而临床ASD患者通常只携带单个基因（NCOR1或NCOR2）的杂合突变，因此尚不清楚NCOR1是否单倍剂量不足、单个基因突变是否足以导致智力障碍，以及NCOR功能缺失如何下调GABA-A受体基因表达、能否通过药物重定位进行治疗。本研究针对上述关键问题展开。

研究人员构建了两种新的遗传修饰小鼠模型：将Ncor1 loxP/+小鼠与β-actin-Cre转基因小鼠杂交获得全身杂合敲除（NCOR1^+/?）小鼠；通过胚胎干细胞打靶技术构建携带ASD患者来源的NCOR1 c.2182+2T>G突变的小鼠（NCOR1^KI/+），该突变导致外显子跳跃和移码，预期产生截短蛋白或触发无义介导的mRNA降解，脑内NCOR1蛋白水平显著降低但未检测到截短蛋白。snRNA-seq分析显示，NCOR1^KI/+小鼠下丘脑GABA能神经元中神经调节蛋白Nrg1/3表达上调、GABA-A受体亚基Gabra2表达下调。体外培养的Neuro-2a细胞中，Nrg1过表达足以抑制Gabra2表达；NRG1-ErbB拮抗剂螺内酯可阻断全长NRG1诱导的Gabra2下调，但不影响NRG1胞内结构域（NRG1-ICD）介导的下调，证明该过程依赖非经典NRG反向信号通路。行为学结果显示，两种模型小鼠均表现出社会记忆、空间记忆、物体识别记忆等认知缺陷及刻板行为。螺内酯和GABA-A受体正性调节剂别孕烯醇酮（均为FDA批准药物）均能有效改善认知功能，且螺内酯还能上调NCOR1^KI/+小鼠下丘脑Gabra2表达。最后，研究者在一名携带MECP2致病突变（c.397C>T, p.Arg133Cys）的7岁女性自闭症患者中开展了开放标签临床试验，给予口服螺内酯（2 mg/kg/天）治疗3个月，该患者在自闭症诊断观察量表（ADOS2）、儿童自闭症评定量表（CARS）、孤独症行为检查表（ABC）、执行功能、适应性行为、语言发育及行为问题等多个维度均表现出明显改善，而携带CACNA1A突变的对照患者改善幅度远小于该患者，且全程无不良事件发生。该研究首次证明NCOR1杂合突变通过单倍剂量不足导致认知障碍，揭示NRG反向信号—GABA-A受体下调这一分子机制，并提出利用FDA批准药物进行药物重定位的治疗策略。

研究人员采用的主要技术方法包括：①利用PHENOMIN（法国）和Jackson实验室来源的Ncor1 loxP/+小鼠与β-actin-Cre杂交构建杂合敲除模型，以及利用上海模型生物中心通过胚胎干细胞同源重组构建NCOR1 c.2182+2T>G敲入模型；②对6月龄NCOR1^KI/+及野生型对照小鼠下丘脑进行单核RNA测序（snRNA-seq，10x Genomics平台），共获得20,093个细胞核，鉴定出12种细胞类型；③采用CellChat算法推断细胞间通讯变化，采用SCENIC算法推断转录因子调控网络；④使用Neuro-2a小鼠神经细胞系进行质粒转染、RT-qPCR、Western blot等体外机制验证；⑤开展标准化小鼠行为学测试（新物体识别、物体位置识别、三箱社交、Morris水迷宫、Y迷宫、旷场、高架十字迷宫、大理石掩埋等）；⑥在齐鲁医院开展两例儿童的探索性临床研究（注册号NCT06678685），评估螺内酯的疗效与安全性。

研究结果分七个部分。第一部分“Ncor1单倍剂量不足导致认知损伤和重复行为”：通过NCOR1^+/?小鼠的行为学测试发现，该小鼠在新物体识别（NOR）、三箱社交记忆（3CH-SM）和Morris水迷宫（MWM）中表现显著受损，并出现大理石掩埋行为增加等刻板行为，但基础社交互动、焦虑水平和运动能力基本正常，证明Ncor1单倍剂量不足足以引起认知功能障碍和重复行为。第二部分“携带ASD相关NCOR1变异的杂合敲入小鼠表现出认知功能障碍”：NCOR1^KI/+小鼠脑内NCOR1 mRNA和蛋白水平均降低，行为表型与杂合敲除小鼠高度相似，包括NOR、物体位置识别（OLR）、3CH-SM和MWM等多任务认知缺陷及刻板行为增加，证实该患者来源突变通过杂合功能缺失致病。第三部分“NCOR1缺乏上调神经调节蛋白（Nrg）并下调GABA-A信号”：snRNA-seq显示ASD相关GWAS风险基因集在NCOR1^KI/+小鼠神经元中显著富集，神经元间通讯增强；NRG信号是上调最显著的外向信号通路，而GABA-A和GABA-B信号均下调；进一步亚聚类显示Gabra2下调主要发生在GABA能神经元而非谷氨酸能神经元，且下丘脑外侧区GAD67阳性神经元中cFos阳性比例升高，提示神经元过度激活。第四部分“NRG反向信号参与NCOR1介导的GABA-A受体调控”：在Neuro-2a细胞中，全长NRG1或NRG1-ICD过表达均能下调Gabra2 mRNA和蛋白水平；螺内酯仅能阻断全长NRG1诱导的Gabra2下调，不能阻断NRG1-ICD诱导的下调，说明NRG1通过非经典反向信号（ICD入核）抑制Gabra2转录；SCENIC分析提示Pparg、Taf1、Rfx2、Six3等转录因子活性升高可能驱动Nrg1上调，而Ahr、Rarb等调控Gabra2的转录因子活性降低。第五部分“增强GABA-A受体信号可减轻NCOR1^KI/+小鼠认知功能障碍”：GABA-A受体激动剂SL651498和正性变构调节剂别孕烯醇酮均能显著改善NCOR1^KI/+小鼠在NOR、OLR和3CH-SM中的认知表现，且不影响基础社交和探索行为，提示GABA-A受体是有效治疗靶点。第六部分“药理学靶向NRG1信号改善NCOR1^KI/+小鼠认知”：螺内酯全身给药可改善NOR、OLR、MWM、Y迷宫和3CH-SM中的认知缺陷，且不改变焦虑和运动能力；螺内酯对刻板行为无改善作用，而别孕烯醇酮可部分改善，提示认知缺陷与刻板行为可能由不同机制驱动；RT-qPCR证实螺内酯上调下丘脑Gabra2表达，Western blot显示NCOR1^KI/+脑内NRG1水平升高且被螺内酯逆转。第七部分“NRG1信号抑制剂挽救MECP2变异患者的认知功能障碍”：在MECP2突变自闭症患者中，螺内酯治疗3个月后ADOS2社会互动评分改善20%、限制性/重复行为评分改善25%，CARS总分下降16.7%，ABC总分下降20.8%，执行功能各维度改善16.7%–46.7%，Vineland-3适应性行为和社交领域分别改善19.4%和44.4%，语言词汇等多项指标亦有明显进步，且无不良事件发生，提供了临床概念验证。

讨论部分指出，本研究首次证实杂合NCOR1功能缺失突变足以引起ASD相关表型，并建立了NCOR1^KI/+小鼠模型。GABA-A受体下调导致的兴奋/抑制（E/I）失衡是ASD的重要病理机制之一，既往研究在多种ASD模型和患者脑组织中发现GABA受体异常。本研究中GABA-A受体激动剂在成年模型小鼠中仍能有效改善认知，说明认知缺陷并非不可逆的发育异常。NRG信号在神经系统发育和突触可塑性中具有重要作用，但NRG1过度表达或活性异常同样导致病理改变，NCOR1通过维持NRG1信号的精细平衡参与认知调控。螺内酯改善认知但不改善刻板行为，提示两者病因机制不同。研究局限性包括：可能存在ErbB下游正向信号等其他机制的参与；螺内酯还具有盐皮质激素受体和雄激素受体拮抗作用，不能完全排除其他通路的贡献；临床研究仅为单例开放标签试验，缺乏盲法和安慰剂对照；患者携带的是MECP2突变而非NCOR1突变，尚不能直接验证NCOR1-GABRA2轴在该患者中的作用。研究结论为：NCOR1单倍剂量不足通过上调NRG1并经由非经典反向信号下调GABA-A受体，导致下丘脑GABA能神经元过度激活和认知功能障碍；FDA批准的螺内酯和别孕烯醇酮可通过药物重定位策略改善NCOR/MECP2相关自闭症患者的认知功能，为后续临床验证提供了概念依据。