高内涵成像流程用于急性髓系白血病（AML）亚型的单细胞药物反应谱分析

《SLAS Discovery》：High-content imaging workflow for single-cell drug response profiling of acute myeloid leukemia subtypes

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）表现出显著的细胞异质性，这种异质性导致治疗反应多变，并限制了常规功能检测的预测能力。虽然群体水平的活力测定能提供聚合读数，但无法解析异质性群体中的表型多样性和动态细胞状态。本研究中，研究人员建立了一种高内涵荧光成像流程，用于在单细胞分辨率下对AML进行定量药物反应谱（drug response profiling, DRP）分析。该检测整合三种无毒荧光染料，以捕获核形态、线粒体功能和细胞凋亡的特征。自动化高内涵成像结合计算图像分析，能够对数千个单个细胞进行稳健分割和表型特征提取。通过有监督机器学习方法，细胞被分为活细胞、凋亡细胞和死亡细胞三种状态，从而利用群体归一化指标对药物反应进行定量评估。该方法允许将基于图像的数据直接整合至下游分析流程，有助于生成功能性剂量-反应曲线，并在单细胞分辨率下确定半数抑制浓度（IC₅₀）值和药物敏感性评分（drug sensitivity score, DSS）。该流程在7株AML细胞系中进行了验证，包括BCL-2抑制获得性耐药和突变驱动耐药的模型。针对维奈克拉（venetoclax, VEN）生成的基于图像DRP，与基于ATP的细胞活力读数（CellTiterGlo?, CTG）获得的既定群体测量结果高度一致。此外，对代表多种作用机制的16种化合物组合进行筛选，结果显示基于图像和基于CTG的药物反应谱之间存在稳健的一致性，同时以单细胞分辨率提供额外的表型信息。最后，该流程被成功转移到原代AML样本。一项包含31种化合物的先导性药物筛选确定BCL-2抑制剂为最具活性的化合物，这与患者的分子图谱一致。综上，该流程为AML中的高分辨率药物谱分析和表型分层建立了一个可扩展的功能表型组学平台。单细胞成像与基于人工智能（AI）分析的整合，为未来的功能性精准肿瘤学方法提供了有前景的基础，并在患者特异性DRP和联合治疗方案优化方面具有潜在应用价值。

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）是高度异质的血液系统恶性肿瘤，克隆异质性和多基因共突变使基于基因组特征的精准医学对治疗反应的预测能力有限，仅有约5–10%患者能从基因匹配治疗中显著获益。即使突变谱相似，患者对靶向治疗或化疗的反应仍可能差异显著；白血病干/祖细胞持续存在以及适应性耐药机制进一步导致治疗失败和复发。常规群体活力测定（如ATP法）仅提供单一聚合读数，无法解析细胞间表型差异和动态变化；流式药物反应谱虽可区分免疫表型亚群，但受限于预定义标记，缺乏形态和空间信息。因此，建立一种快速、可扩展且保持细胞完整性的单细胞分辨率功能分析方法具有重要意义。

研究人员建立了一套整合活细胞荧光三重染色、自动化高内涵成像、AI辅助单细胞分类和iTReX剂量-反应建模的高内涵成像DRP流程，并在7株AML细胞系、获得性/突变驱动耐药模型及原代患者样本中进行了系统验证。结果显示，该流程与CTG和流式细胞术结果高度一致，并能提供额外表型信息；在原代样本中可识别BCL-2抑制剂的高敏感性。该工作建立了可扩展的功能表型组学平台，为功能性精准肿瘤学奠定基础。

关键技术方法包括：将AML细胞接种至预置药物的384孔板，孵育72小时后加入Hoechst 33342、四甲基罗丹明乙酯和Annexin-V三种无毒荧光染料进行活细胞染色；用Opera Phenix Plus高内涵成像系统获取单细胞图像；用Harmony 5.3软件进行细胞分割和572个特征提取；用有监督PhenoLOGIC?线性分类器将细胞分为活、凋亡和死亡状态；计算校正存活分数（CSF）作为归一化药效指标；使用iTReX平台拟合剂量-反应曲线并计算IC₅₀和DSS；用t-SNE对凋亡/死亡细胞表型进行降维聚类。样本包括7株AML细胞系以及UCT生物库冻存的原代AML样本。

研究结果如下：

3.1 高内涵成像参数优化
研究人员以MOLM-13为模型，优化了接种密度（10,000细胞/孔）、染色体积（10 μL）和振荡条件（1200 rpm，5 min），消除了细胞偏移伪影，实现均匀分布；Annexin-V最佳稀释度为1:500，无需额外补钙即可获得清晰的凋亡/死亡信号。

3.2 功能验证与单细胞分类
DMSO、STS、VEN和BzCl对照处理表明，活、凋亡和死亡细胞可通过Hoechst、TMRE、AV荧光组合区分。经训练的有监督分类器在MOLM-13中MCC=0.990、F1-score=0.996，并能通过CSF时间动力学区分VEN敏感的MOLM-13 S与耐药的MOLM-13 VR模型。

3.3 基于图像的药物反应谱分析
VEN基准实验显示，CSF来源的剂量-反应曲线与CTG高度一致，敏感株MOLM-13 S（IC₅₀=4.05 nM，DSS=29.57）和MV4-11（IC₅₀=3.47 nM，DSS=33.3）与耐药株MOLM-13 VR（IC₅₀=79.95 μM）、MOLM-13 G（IC₅₀=5.68 μM）及OCI-AML3（IC₅₀=373.3 nM）区分明显；图像法与Annexin V/7-AAD流式细胞术的VEN剂量-反应曲线高度一致（IC₅₀ 4.92 vs 4.05 nM；DSS 25.08 vs 28.29）。在16种化合物的筛选中，图像与CTG整体一致，但FLT3抑制剂在MV4-11和Kasumi-1中出现读数差异，这与CSF和CTG反映的生物学信息不同有关；t-SNE显示相同作用机制的化合物形成表型聚类。

3.4 原代AML样本概念验证
3份UCT生物库冻存样本可成功转移染色、成像和分类流程；对AML-2018–00,081样本（ASXL1+、RUNX1+、BCOR+、NRAS+，FLT3-ITD?、NPM1?、IDH1?、IDH2?）进行31化合物20 h筛选，图像与CTG均显示VEN和sonrotoclax（DSS>10）最有效，与患者分子背景一致；Idarubicin基于图像DSS高于CTG，说明图像可捕捉ATP测定未完全反映的细胞状态转换。

讨论指出，该流程从细胞接种到定量DRP约一周，自动化程度高；相比CTG等群体读数，单细胞状态分类可识别残留活克隆，对功能精准肿瘤学有价值；图像与流式或CTG之间的差异反映互补信息。局限性包括批量效应、分割/分类准确性、染料毒性、非凋亡死亡模式以及聚焦平面丢失细胞；未来将优化原代样本培养条件、扩展谱系CD标记和细胞周期分析并完善AI管线。研究结论：综上，本工作流程建立了一个可扩展、信息丰富的表型药物分析平台，整合单细胞成像、AI分析和药物反应的功能表征；通过实现对细胞异质性的高分辨率解析，该方法正朝着数据驱动、表型药物分析引导的精准肿瘤学策略迈进。