星形胶质细胞SMN恢复联合Forskolin治疗改善脊髓性肌萎缩症突触病理

《Annals of Neurology》：Astrocyte SMN Restoration and Forskolin Treatment Improve SMA Synaptic Pathology

　　

目的：脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy, SMA）患者中枢传入突触功能障碍的早期表型是治疗开发的关键靶点，但其潜在疾病机制尚未明确。通过进一步研究人类SMA疾病病理中的运动神经元突触和突触周围星形胶质细胞突起（peri-synaptic astrocyte process, PAP）缺陷，研究人员旨在开发一种改善运动神经元功能的新型治疗策略。

方法：研究人员利用健康受试者和SMA患者的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）衍生培养体系，分别通过细胞表面捕获质谱蛋白质组学、共聚焦和超分辨率显微镜、突触胶质体（synaptogliosome, SG）分离及电生理学，评估星形胶质细胞突起内（单培养）和PAP-突触界面（共培养）内在发生的表型。

结果：SMA星形胶质细胞表现出内在的丝状伪足肌动蛋白缺陷，其特征为肌动蛋白相关细胞表面N-糖蛋白丰度低、肌动蛋白重塑刺激后丝状伪足密度和CDC42-GTP水平降低，以及磷酸化ezrin、radixin和moesin（pERM）蛋白显著减少。在SMA运动神经元与星形胶质细胞共培养中，研究人员观察到突触数量、肌动蛋白相关突触素I表达以及PAP相关pERM蛋白表达同步减少。研究人员采用SMN1基因治疗联合毛喉素处理的双重治疗范式，通过增加环磷酸腺苷水平刺激肌动蛋白动力学，结果增加了SMA星形胶质细胞的分支和丝状伪足密度，并改善了SMA运动神经元的突触形成和功能。

解读：研究人员定义了影响SMA星形胶质细胞丝状伪足动力学和运动神经元突触功能的肌动蛋白相关缺陷。这塑造了针对SMN依赖性和肌动蛋白相关疾病机制的治疗策略，总体上改善了运动神经元功能和疾病病理。ANN NEUROL 2026

脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy, SMA）是由运动神经元存活基因1（SMN1）突变导致SMN蛋白水平下降、进而引起脊髓运动神经元变性、肌萎缩和呼吸功能衰竭的儿科神经肌肉疾病。本体感觉传入突触功能障碍是SMA最早出现的疾病表型之一，但驱动该表型的星形胶质细胞相关机制尚不清楚。已有证据表明，星形胶质细胞介导的机制可加重SMA运动神经元功能障碍，且单纯恢复星形胶质细胞中的SMN仅能部分改善体外表型。由于肌动蛋白细胞骨架可独立于SMN影响疾病严重程度，研究人员提出联合靶向SMN依赖性机制和肌动蛋白相关机制可能提高疗效。该研究旨在进一步解析人类SMA病理中运动神经元突触与突触周围星形胶质细胞突起（peri-synaptic astrocyte process, PAP）的缺陷，并开发改善运动神经元功能的新型治疗策略。

研究人员利用健康受试者与SMA患者诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）来源的星形胶质细胞单培养和运动神经元-星形胶质细胞共培养体系，采用微尺度细胞表面捕获质谱、共聚焦与结构照明显微镜、突触胶质体（synaptogliosome, SG）分离、蛋白质印迹和免疫细胞化学、ATP耗竭/恢复诱导的肌动蛋白重塑、CDC42-GTP G-LISA、FiloQuant形态学定量、全细胞膜片钳电生理及多电极阵列（multi-electrode array, MEA）等方法开展研究。治疗策略包括星形胶质细胞靶向SMN1慢病毒基因转导（SMN:FLAG或SMN:GFP）和/或毛喉素（forskolin）处理。

研究结果如下。

**SMA星形胶质细胞表面蛋白质组与肌动蛋白重塑缺陷**：细胞表面捕获质谱显示，SMA与健康星形胶质细胞的表面N-糖蛋白组存在显著分离；共276种表面N-糖蛋白中81种在两组间丰度差异显著，其中44种升高、37种降低。升高的蛋白与炎症反应和星形胶质细胞反应性相关，降低的蛋白则涉及肌动蛋白细胞骨架动力学、神经毡浸润和突触可塑性，包括CD44、TENM2和TNC等。功能实验显示，SMA星形胶质细胞在基线时丝状伪足密度即显著低于健康细胞，经ATP耗竭/恢复刺激后健康细胞丝状伪足密度增加，而SMA细胞无明显变化；SMA细胞中CDC42-GTP水平在肌动蛋白重塑刺激后未出现健康细胞中的升高趋势。

**SMA星形胶质细胞丝状伪足中CD44与pERM表达降低**：免疫细胞化学和结构照明显微镜显示，SMA星形胶质细胞丝状伪足中CD44、磷酸化ezrin/radixin/moesin（pERM）及谷氨酸转运体EAAT1信号均降低。Imaris斑点定量证实，基线及肌动蛋白重塑刺激后，SMA星形胶质细胞丝状伪足中pERM、CD44及共定位的CD44/pERM斑点均显著少于健康细胞。

**Forskolin与SMN基因治疗改善SMA星形胶质细胞表型**：毛喉素单独处理不增加SMN蛋白水平，但可增加SMA星形胶质细胞基线及肌动蛋白重塑恢复期的丝状伪足密度。SMN:FLAG或SMN:GFP转导的SMA星形胶质细胞基线丝状伪足密度升高至接近健康水平；在肌动蛋白重塑恢复期加入毛喉素（NaN3+R(F)）可使SMN转导细胞出现显著分支和星形化，丝状伪足密度达到健康细胞相同处理水平，且CDC42-GTP水平与健康细胞相当。

**共培养体系中突触与PAP缺陷及治疗改善**：在SMA运动神经元-星形胶质细胞共培养中，突触前蛋白SYN1/2与突触后蛋白PSD95共定位形成的突触数量以及pERM标记的预测PAP区域均显著低于健康共培养。SG分离结果确认SMA样本中SMN减少，且男性SMA样本中SYN1水平降低。对SMA共培养施加星形胶质细胞靶向SMN1基因治疗和/或毛喉素处理后，突触数量显著增加；联合处理还轻度改善pERM表达，并提高SG组分中SMN和SYN1水平。

**SMA运动神经元电生理功能改善**：全细胞膜片钳记录显示，SMA共培养运动神经元的输入电阻（R_in）显著高于健康组，动作电位发放频率更高，而静息膜电位和膜电容无明显差异。SMN基因转导和/或毛喉素处理均可逆转R_in升高并降低动作电位发放频率；但仅SMN转导联合毛喉素处理可恢复SMA运动神经元降低的基强度（rheobase）。

**多电极阵列网络活动改善**：健康共培养可检测到自发网络爆发活动，而SMA共培养仅在双重治疗条件下出现自发网络爆发。毛喉素处理可提高SMA运动神经元加权平均发放率，但只有“SMN转导+毛喉素”双重治疗可显著增加爆发事件数量。

讨论部分指出，SMA星形胶质细胞存在非细胞自主性肌动蛋白重塑缺陷，包括CD44-透明质酸信号异常、pERM减少和丝状伪足动力学受损，这些改变可能通过PAP影响运动神经元突触形成与维持。SMA运动神经元在共培养中表现为过度兴奋，伴随SYN1减少和突触数量下降，研究人员推测这是突触形成/传递受损后的代偿性改变。由于单独毛喉素可改善突触前SYN1水平和运动神经元功能，而联合SMN基因治疗可在共培养中提高SMN水平并稳定改善突触数量与电生理指标，该研究提供了联合SMN恢复与cAMP/肌动蛋白调节可改善人类SMA突触病体外模型的证据。研究结论为：SMA中存在影响星形胶质细胞丝状伪足动力学和运动神经元突触功能的肌动蛋白相关缺陷；靶向SMN依赖性和肌动蛋白相关机制的联合治疗策略可改善运动神经元功能与疾病病理，为SMA治疗开发提供了概念验证依据。