《Cardiovascular Therapeutics》：Esmolol Alleviates Sepsis-Associated Myocardial Injury by Acting on the APAF1 and JAK2/STAT3 Inflammatory Pathways
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目的：本研究旨在探讨艾司洛尔对脓毒症相关心肌损伤（sepsis-associated myocardial injury, SAMI）的保护作用及其潜在分子机制。
方法：从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO，数据集GS
目的：本研究旨在探讨艾司洛尔对脓毒症相关心肌损伤（sepsis-associated myocardial injury, SAMI）的保护作用及其潜在分子机制。
方法：从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO，数据集GSE267388）中筛选出SAMI相关的差异表达基因。利用PharmMapper预测艾司洛尔的潜在靶点。对重叠基因进行富集分析和分子对接分析。研究人员以脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）处理H9C2细胞建立损伤模型，随后给予艾司洛尔干预。评估细胞活力、凋亡、氧化应激及线粒体功能。采用逆转录定量聚合酶链反应（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）和蛋白质印迹法检测凋亡蛋白酶激活因子1（apoptotic protease activating factor 1, APAF1）及JAK2/STAT3通路分子的表达。利用大鼠脓毒症模型验证心功能、炎症、氧化应激及相关蛋白表达。
结果：共筛选出6个核心靶点，其中艾司洛尔与APAF1的结合能力最强。艾司洛尔可提高细胞活力，减少凋亡、活性氧（reactive oxygen species, ROS）和丙二醛（malondialdehyde, MDA），恢复线粒体膜电位，下调APAF1、Bax、cleaved-caspase-9/3的表达，并抑制JAK2/STAT3磷酸化。艾司洛尔可逆转APAF1过表达诱导的损伤。在体内实验中，艾司洛尔可减轻心肌病理损伤，降低心肌损伤标志物及炎症因子浓度，并抑制APAF1及JAK2/STAT3通路。
结论：艾司洛尔通过双重抑制APAF1线粒体凋亡通路和JAK2/STAT3炎症通路发挥对SAMI的保护作用，其中APAF1可能是艾司洛尔发挥作用的关键下游靶点。
论文解读
一、研究背景与科学问题
脓毒症是由感染引起的全身性、失调的炎症反应所导致的危及生命的多器官功能障碍综合征，其死亡率极高。心脏是脓毒症最易受损的器官之一。脓毒症相关心肌损伤（sepsis-associated myocardial injury, SAMI）是脓毒症的常见且严重并发症，以心脏收缩和舒张功能受损、心肌细胞凋亡增加及促炎细胞因子过度释放为主要特征。SAMI是脓毒症患者预后不良和死亡的独立危险因素，死亡率超过70%。目前针对SAMI尚缺乏特异性的靶向治疗策略，因此阐明其潜在分子机制并寻找有效治疗靶点具有重要的临床和科学意义。
艾司洛尔是一种短效、高选择性β1-肾上腺素能受体阻滞剂，临床上广泛用于心肌病患者的心率控制和术后高血压管理。越来越多的证据表明，艾司洛尔在心血管调节作用之外还具有抗炎和抗凋亡效应，但其精确的分子靶点和潜在机制尚不清楚。既往研究报道艾司洛尔可通过调控α7 nAChR/STAT3/NF-κB轴、AMPK/mTOR/ULK1通路及TLR4/NF-κB信号通路减轻脓毒症心肌损伤，然而其核心基因和分子机制仍不明确。
凋亡蛋白酶激活因子1（APAF1）是线粒体凋亡通路中的关键枢纽分子，与细胞色素C和dATP结合形成凋亡体，激活caspase-9/caspase-3级联反应。JAK/STAT通路是多种细胞因子介导的自身免疫和炎症疾病的潜在治疗靶点。脓毒症时LPS等刺激可诱导JAK2和STAT3异常磷酸化激活，促进IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎细胞因子的过度分泌。JAK2/STAT3通路与APAF1之间可能存在间接调控关系，同时靶向JAK2/STAT3和APAF1以阻断其级联激活，可能是防治SAMI的关键策略。
二、研究设计与核心发现
研究人员整合了生物信息学分析、分子对接、体外心肌细胞损伤模型和大鼠脓毒症模型，系统研究了艾司洛尔对SAMI的保护作用。研究结果表明，艾司洛尔通过双重抑制APAF1介导的线粒体凋亡通路和JAK2/STAT3介导的炎症通路发挥心肌保护作用，其中APAF1可能是艾司洛尔的关键下游靶点。这一发现为SAMI的临床治疗策略优化提供了新的实验依据。
三、主要技术方法
研究人员从GEO数据库（GSE267388数据集，包含5只LPS诱导的脓毒症小鼠和5只对照C57BL/6雄性小鼠的心脏样本）获取SAMI相关mRNA表达谱数据，使用DESeq2 R包进行差异表达分析。利用PharmMapper网络服务器预测艾司洛尔的潜在靶蛋白，获得375个高匹配度潜在靶点。将差异表达基因与艾司洛尔预测靶点取交集，使用ClusterProfiler R包进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。从PDB数据库获取蛋白三维晶体结构，使用AutoDock Vina 1.2.5进行分子对接分析，并使用GROMACS 2024.5软件结合CHARMM36力场进行100 ns全原子分子动力学模拟。体外实验使用大鼠H9C2心肌细胞（购自武汉SUNNCELL Biotechnology），以10 μg/mL LPS处理24小时建立损伤模型，随后给予不同浓度艾司洛尔干预。体内实验使用32只SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠（购自北京华阜康生物科技股份有限公司），随机分为对照组、模型组、艾司洛尔25 mg/kg组和艾司洛尔50 mg/kg组，通过腹腔注射LPS（10 mg/kg）建立脓毒症模型。此外还使用了人源数据集GSE243217进行外部验证。
四、研究结果
4.1 SAMI相关差异表达基因与艾司洛尔靶点的筛选
从GSE267388数据集中鉴定出1429个SAMI相关差异表达基因和375个艾司洛尔预测靶点，二者交集获得51个共同基因，可能参与艾司洛尔对SAMI的改善作用。
4.2 通路富集与核心基因筛选
GO和KEGG富集分析显示，重叠基因主要富集在质膜蛋白定位、经STAT的细胞表面受体信号通路、炎症反应中白细胞活化等生物学过程，以及PD-L1表达和PD-1检查点通路、凋亡等KEGG通路。从显著富集通路中提取出6个核心基因：JAK2、SPHK1、CCL5、CSF1R、APAF1和BIRC2。外部数据集GSE243217验证显示APAF1、JAK2、BIRC2和CSF1R在脓毒症组中表达显著升高，与初始分析结果一致。
4.3 艾司洛尔与APAF1可稳定结合
分子对接结果显示，艾司洛尔与APAF1、SPHK1、BIRC2、JAK2、CCL5和CSF1R的结合能分别为?7.73、?7.05、?6.30、?6.05、?4.46和?4.27 kcal/mol，其中与APAF1的结合亲和力最高。100 ns全原子分子动力学模拟显示，艾司洛尔与APAF1和JAK2均形成稳定且持久的复合物。细胞热位移分析（CETSA）进一步证实艾司洛尔在细胞内与APAF1发生直接物理相互作用。
4.4 艾司洛尔改善LPS诱导的H9C2细胞活力降低
CCK-8实验显示，10 μg/mL LPS处理24小时显著降低H9C2细胞相对活力。艾司洛尔浓度从0.1 μM增至2 μM时细胞活力逐渐恢复，2 μM艾司洛尔保护效果最显著，细胞活力恢复至83.03%。4 μM时未见进一步改善，因此选择1和2 μM作为后续机制实验的工作浓度。
4.5 艾司洛尔显著减轻LPS诱导的H9C2细胞凋亡和氧化损伤
流式细胞术和TUNEL染色显示，LPS模型组凋亡率显著升高，艾司洛尔干预后凋亡率显著降低。LPS刺激导致细胞内ROS浓度和MDA含量显著增加，艾司洛尔可降低ROS浓度和MDA产生。LPS刺激引起线粒体膜电位显著下降，艾司洛尔治疗可显著改善。
4.6 艾司洛尔下调APAF1表达并抑制线粒体凋亡通路激活
RT-qPCR和Western blot结果显示，LPS模型组APAF1 mRNA和蛋白水平显著上调，促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9表达升高，抗凋亡蛋白Bcl-2下调。艾司洛尔治疗有效逆转了这些变化，表明艾司洛尔可能通过抑制APAF1表达阻断线粒体凋亡级联激活。
4.7 艾司洛尔抑制JAK2/STAT3信号通路并减少炎症因子分泌
ELISA结果显示，LPS模型组细胞培养上清中IL-1β、TNF-α和IL-6浓度显著升高，艾司洛尔干预降低炎症因子分泌。Western blot显示LPS组p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3比值显著升高，艾司洛尔治疗抑制了JAK2和STAT3的磷酸化激活。
4.8 APAF1过表达逆转艾司洛尔对LPS诱导的H9C2细胞损伤的保护作用
在H9C2细胞中过表达APAF1后，与LPS组相比，LPS+oe-APAF1组细胞活力进一步下降，凋亡率升高，ROS和MDA浓度显著升高。艾司洛尔治疗可恢复LPS+oe-APAF1组的细胞活力并逆转细胞损伤。此外，APAF1过表达不影响JAK2和STAT3的磷酸化水平。
4.9 艾司洛尔改善脓毒症大鼠心肌损伤和氧化应激
超声心动图显示，LPS模型组大鼠心率增加，EF%和FS%显著降低，LVEDD和LVESD显著增大。艾司洛尔治疗改善了心功能指标。HE染色显示模型组心肌结构紊乱、细胞变性、心肌纤维断裂，艾司洛尔干预显著减轻病理损伤。模型组心肌MDA含量显著增加，ATP含量和SOD活性降低，艾司洛尔逆转了这些异常。模型组血清LDH、CK-MB、cTnI和cTnT浓度以及心肌TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著升高，艾司洛尔治疗后降低。
4.10 艾司洛尔通过调控APAF1介导的凋亡通路和JAK2/STAT3炎症通路发挥心脏保护作用
与对照组相比，脓毒症大鼠心肌组织中APAF1和促凋亡分子（Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9）蛋白浓度显著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2下调。艾司洛尔干预逆转了这些异常表达，抑制了APAF1及下游促凋亡蛋白的表达。模型组JAK2和STAT3磷酸化水平显著升高，艾司洛尔治疗抑制了JAK2和STAT3的激活。
五、讨论与结论
脓毒症是细菌感染或其他致病因素引发的全身性炎症反应，可导致多器官功能障碍。SAMI是脓毒症患者死亡的主要原因，其病理机制涉及过度炎症反应、线粒体功能障碍和心肌细胞凋亡。本研究通过生物信息学预测和实验验证，提出了一种新的调控机制：在SAMI背景下，艾司洛尔通过直接作用于APAF1阻断线粒体凋亡。体外实验证实艾司洛尔通过抑制APAF1介导的凋亡通路发挥抗凋亡作用，同时显著抑制JAK2和STAT3的磷酸化激活，减少IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎细胞因子分泌。体内实验进一步证实艾司洛尔可有效改善左心室收缩和舒张功能，减轻心肌组织病理损伤，降低心肌损伤标志物水平，抑制氧化应激和促炎细胞因子释放。
本研究存在一定局限性。关于JAK2/STAT3通路的抑制，本研究未探讨其与APAF1调控之间的上下游时间关系，也未阐明二者之间是否存在独立调控机制。艾司洛尔对脓毒症模型心率和血流动力学的直接调节作用可能对心功能改善有所贡献，尽管体外实验排除了血流动力学干扰，但体内环境的复杂性需要进一步实验区分各因素的贡献。此外，本研究采用的LPS腹腔注射加单次艾司洛尔注射模型存在局限性，未来应采用盲肠结扎穿刺（CLP）模型以及药代动力学/药效学（PK/PD）研究，以更准确地将临床前剂量与临床暴露水平相关联。
研究结论：本研究证实艾司洛尔通过抑制APAF1介导的凋亡和JAK2/STAT3介导的炎症有效减轻脓毒症诱导的心肌损伤。因此，APAF1可能是艾司洛尔发挥保护作用的有效靶点，为SAMI临床治疗策略的优化提供了新的实验证据。
