鸭疫里默氏杆菌跨血脑屏障先锋菌株的鉴定与全基因组测序分析

《Poultry Science》：Identification and whole-genome sequencing of blood-brain barrier-penetrating Riemerella anatipestifer isolated from chickens and ducks

： 鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer, RA）是引起细菌性脑膜炎的主要病原体，对家禽产业构成严重威胁。为鉴定具有较强穿越血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）能力的RA菌株并分析其基因组特征，本研究利用多种不同血清型的RA菌株建立了共感染模型。研究发现，在多种RA菌株共感染过程中，某些RA菌株能够快速穿透BBB，并在感染后0.25小时即从脑组织中分离获得。研究人员进一步筛选出先锋菌株，并在体内和体外评估了其穿越BBB的能力及致病性。对三株先锋菌株和一株无法穿越BBB的RA菌株进行全基因组测序发现，这些菌株具有2.14–2.28 Mb的环状染色体，编码1,982–2,137个蛋白质编码基因。所有菌株均携带40个tRNA基因和9个rRNA基因，并含有9–15个基因组岛。比较基因组学分析揭示了四株菌株间直系同源群组成的差异，耐药基因（每株24–29个）和毒力基因（每株4–57个菌株特异性基因）呈菌株特异性分布，同时转座子和插入序列（IS元件）谱亦存在差异。比较基因组学分析进一步揭示了毒力基因和抗生素耐药基因的菌株特异性分布，凸显了这些分离株的基因组可塑性。综上，这些发现为具有较强BBB穿越能力的RA菌株提供了全面的表型和基因组特征描述，为后续RA穿越BBB的机制研究奠定了基础。

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一、研究背景与问题

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer, RA）是全球水禽养殖业中一种重要的细菌性病原体，可引起鸭传染性浆膜炎及急性或慢性败血症，根据菌株毒力不同，感染雏鸭的死亡率可达5%至75%。近年来，中国肉种鸡和蛋鸡中RA感染的报道提示其宿主范围可能正在扩大，对更广泛的家禽产业构成潜在威胁。由于RA血清型众多、各血清型间交叉保护有限以及抗菌药物耐药性日益严重，RA感染的控制仍然困难。败血症和脑膜炎是该病原体导致鸭死亡的主要原因，而RA严重感染的关键特征是其能够通过血行途径播散并侵入中枢神经系统，成功穿越或破坏血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）是疾病进展的关键步骤。已有研究鉴定出若干参与RA穿越BBB的毒力因子，如OmpA通过其第230–242位氨基酸的关键结构域介导RA侵入鸭脑微血管内皮细胞，从而穿越BBB；IX型分泌系统效应蛋白SspA通过降解occludin和IV型胶原蛋白参与RA感染鸭的BBB破坏。然而，BBB穿越的机制、菌株间在该过程中的潜在差异以及宿主来源相关的基因组特征仍不完全清楚。因此，本研究旨在建立混合感染模型筛选具有较强BBB穿越能力的RA菌株，通过全基因组测序表征其基因组背景并进行比较基因组学分析，为阐明RA穿越BBB的致病机制提供基础。

二、研究内容与结论

研究人员建立了RA多菌株共感染模型，以筛选具有较强BBB穿越能力的先锋菌株。利用7株不同血清型（1、2、5、6、10、11和12型）的鸭源RA菌株混合感染雏鸭，发现在感染后0.25小时即有RA从脑组织中分离，血清学分析表明仅有一种血清型（5、6或12型）的RA在感染后0.25小时从脑组织中被分离，提示存在负责BBB穿越的先锋RA菌株。随后，研究人员分别用17株鸭源RA和15株鸡源RA混合感染雏鸭和雏鸡，筛选出四株先锋菌株，分别命名为RA-DD（鸭源/鸭感染）、RA-DC（鸭源/鸡感染）、RA-CD（鸡源/鸭感染）和RA-CC（鸡源/鸡感染），血清型分别为12、12、6和1型。经心脏灌注验证，四株先锋菌株均能在相应最早脑分离时间点从灌注后的脑组织中分离，而无法穿越BBB的RA-1菌株仅能在血液中检出而不能从灌注后的脑组织中检出，进一步证实了先锋菌株具有更强的BBB穿越能力。体外致病性评估显示，RA-DD、RA-DC和RA-CD对鸡胚成纤维细胞（CEFs）和鸭胚成纤维细胞（DEFs）均具有较强的黏附和侵袭能力，而RA-CC对这两种细胞的黏附和侵袭能力较低，但对Vero细胞表现出较强的侵袭能力。四株先锋菌株对DEFs的侵袭能力普遍强于对CEFs的侵袭能力。四株先锋菌株均表现出较弱的生物膜形成能力，显著低于RA-1。溶血活性测定显示三株先锋菌株无溶血现象，而RA-1为β-溶血。药敏试验显示五株菌均对磺胺异噁唑、氟苯尼考和强力霉素敏感，对链霉素、庆大霉素和多粘菌素B耐药，均被归类为多重耐药（MDR）菌株。

全基因组测序结果显示，RA-1、RA-DC、RA-CD和RA-CC具有单一环状染色体，大小分别为2,206,226 bp（GC含量34.87%）、2,139,291 bp（35.05%）、2,260,821 bp（34.97%）和2,280,681 bp（34.98%）。RA-CD和RA-CC分别携带21,558 bp和21,692 bp的质粒，而RA-1和RA-DC无质粒。四株菌预测开放阅读框（ORFs）为1,982至2,137个，编码序列占基因组的88.69%至89.82%。所有菌株均含相同数量的tRNA和rRNA基因，而ncRNA拷贝数在菌株间存在差异。前噬菌体预测在RA-1、RA-DC、RA-CD和RA-CC中分别鉴定出11、13、10和18个前噬菌体区域。转座子谱和基因组岛数量存在菌株水平差异，RA-1携带最多的转座子记录和预测基因组岛。GO、KEGG和COG功能注释显示四株菌具有大致相似的功能特征，其中GO注释中生物学过程为主要类别，KEGG分析显示大多数注释基因与信号转导、碳水化合物代谢、氨基酸代谢和遗传信息处理相关，COG注释显示细胞壁/膜/包膜生物合成是最丰富的类别。

比较基因组学分析中，OrthoFinder分析鉴定出每株菌1,923至2,088个总直系同源群，RA-DC含最少的总直系同源群，RA-CC最多；RA-1、RA-DC、RA-CD和RA-CC分别含有165、118、16和15个单拷贝基因。毒力因子分析显示，鸡源分离株与鸭源先锋菌株（RA-C和RA-D）之间共享17个基因，而RA-C和RA-D分别携带46和57个菌株特异性毒力基因。预测的抗生素耐药相关基因结果显示，RA-1有29个耐药基因，RA-DC有25个，RA-CD有24个，RA-CC有26个。毒力相关基因比较分析确定了四株菌的菌株特异性谱，RA-DC含最多菌株特异性推定毒力相关基因（57个），其次是RA-1（37个）、RA-CD（11个）和RA-CC（4个）。预测的毒力相关基因涵盖多个毒力因子类别，包括免疫调节、应激生存、外酶和黏附四大类。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析显示，四株菌分布于不同分支而非形成单一单系群，宿主来源与16S rRNA系统发育分组并非严格相关。

三、关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：建立RA多菌株共感染动物模型进行先锋菌株筛选，通过血清凝集试验进行血清型鉴定；利用鸡胚成纤维细胞（CEFs）、鸭胚成纤维细胞（DEFs）和Vero细胞进行黏附与侵袭试验评估体外致病性；采用Kirby-Bauer纸片扩散法进行抗菌药物敏感性测试；利用Nanopore PromethION48平台和Illumina NovaSeq平台进行全基因组测序，结合SPAdes、A5-miseq、Flye和Unicycler软件进行组装；通过GeneMarkS、tRNAscan-SE、Barrnap和Rfam进行基因预测；利用PhiSpy和IslandViewer4预测前噬菌体和基因组岛；通过VFDB和CARD数据库检索毒力基因和耐药基因；利用OrthoFinder进行直系同源群分析；基于16S rRNA基因序列在MEGA12中构建最大似然法系统发育树。菌株来源于2024至2025年间山东省采集的鸡和鸭样本，共分离鉴定32株RA菌株（15株鸡源和17株鸭源）。

四、研究结果

先锋RA菌株是共感染中BBB穿越所必需的：利用7株不同血清型鸭源RA混合感染雏鸭，发现感染后0.25小时即有RA进入血液并穿越进入脑组织，血清学分析显示仅有一种血清型从脑组织中被分离，表明存在负责BBB穿越的先锋RA菌株。

先锋RA菌株的筛选与鉴定：分别用鸭源和鸡源RA菌株混合感染雏鸭和雏鸡，筛选出四株先锋菌株RA-DD、RA-DC、RA-CD和RA-CC，血清型分别为12、12、6和1型。经心脏灌注验证，先锋菌株仍能从脑组织中分离，而RA-1不能从灌注后的脑组织中检出，证实先锋菌株具有更强的BBB穿越能力。

先锋RA菌株的体外致病性评估：RA-DD、RA-DC和RA-CD对CEFs和DEFs具有较强黏附和侵袭能力，RA-CC对Vero细胞表现出较强侵袭能力。先锋菌株对DEFs的侵袭能力普遍强于CEFs。先锋菌株生物膜形成能力较弱，显著低于RA-1。先锋菌株无溶血现象，而RA-1为β-溶血。五株菌均为多重耐药（MDR）菌株。

全基因组测序：四株菌具有单一环状染色体，大小2.14–2.28 Mb，编码1,982–2,137个蛋白质编码基因。RA-CD和RA-CC携带质粒。所有菌株含40个tRNA基因和9个rRNA基因，含9–15个基因组岛。前噬菌体区域数量在菌株间存在差异。GO、KEGG和COG功能注释显示四株菌具有相似的功能特征。

比较基因组学分析：OrthoFinder分析鉴定出每株菌1,923至2,088个总直系同源群，单拷贝基因数量在菌株间差异显著。鸡源和鸭源菌株共享17个预测毒力基因，各自携带46和57个菌株特异性毒力基因。耐药基因数量为24–29个/株。RA-DC含最多菌株特异性毒力相关基因（57个）。预测毒力相关基因涵盖免疫调节、应激生存、外酶和黏附等类别。

系统发育特征：基于16S rRNA基因序列的系统发育分析显示四株菌分布于不同分支，宿主来源与16S rRNA系统发育分组并非严格相关。

五、讨论与结论

本研究表明，在混合感染条件下，某些RA菌株在BBB穿越中表现出优先性，提示存在“先锋菌株-后续定植”的RA穿越BBB模式。鸭源和鸡源RA分离株均能在异源宿主中表现出BBB穿越能力，提示RA菌株具有跨宿主感染和BBB穿越的潜力，但不同宿主来源的分离株在神经侵袭效率和致病进程上可能存在差异。全基因组测序显示四株菌具有相似的基因组大小、G+C含量和保守的tRNA/rRNA谱，表明RA具有相对保守的物种水平基因组背景，而辅助基因组特征在菌株间存在差异。前噬菌体、转座子和基因组岛的差异表明移动遗传元件和基因组可塑性存在菌株特异性变异。RA-1和RA-CD的前噬菌体区域中分别检测到1个和2个推定毒力相关基因，提示前噬菌体可能作为RA中毒力相关基因的储存库。基因家族分析显示1,601个共同直系同源群占四株菌基因家族的76.5%至82.4%，表明核心基因组相对保守，而单拷贝基因数量差异显著，提示辅助基因组组成存在较大差异。四株菌共享20个耐药基因，但耐药基因型与药敏表型并非完全一致，提示耐药基因的存在并不一定预示表型耐药。毒力基因谱分析显示所有菌株均携带3个黏附相关基因和1个外酶基因，表明黏附和组织侵袭是RA的基本致病机制。ompA和fur在四株菌中均被检测到，而AS87_04050、tbdR1和camp均缺失。RA-CC和RA-CD共享46个预测毒力相关基因，RA-DC含最多菌株特异性推定毒力相关基因。本研究首次建立了用于筛选具有较强BBB穿越能力菌株的混合感染模型，对所选RA菌株的全基因组测序为理解RA中差异BBB穿越表型背后的基因组结构提供了全面概览，为未来研究RA穿越BBB的分子机制奠定了基础。