慢性血栓栓塞性肺动脉高压（CTEPH）肺动脉内膜切除（PEA）组织不同解剖区域的单细胞图谱与免疫-血管重塑异质性

《Clinical and Translational Medicine》：A single-cell census of pulmonary endarterectomies tissue across different anatomical regions in chronic thromboembolic pulmonary hypertension

　　

背景：肺动脉内膜切除术（pulmonary endarterectomy, PEA）仍是慢性血栓栓塞性肺动脉高压（chronic thromboembolic pulmonary hypertension, CTEPH）的潜在治愈性选择之一。该手术可去除近端血栓栓塞物质及其次级分支。然而，不同解剖区域间的细胞景观与病理特征仍理解有限。
方法：对十例接受PEA手术的CTEPH患者和六条参考远端肺动脉进行单细胞转录组学（single-cell transcriptomics）分析，以描绘主部及其分叉部的细胞组成。
结果：主部呈现明显的肌化（muscularised）和纤维化血栓机化，单核吞噬细胞（mononuclear phagocytes, MPs）比例显著增加。炎症反应和促炎活性归因于CD8⁺效应T细胞和自然杀伤（nature killer, NK）细胞亚群以及一个M1样（高IL1B和TNF，极低IL6）表型巨噬细胞亚簇。分叉部以漏斗样（colander-like）病变为主，浆细胞百分比显著增加。免疫失调由CD4初始T细胞诱导，并伴有M2样巨噬细胞向血管壁浸润下调。在分叉部M2样（高MRC1和CD163，几乎无IL1B或TNF）巨噬细胞中观察到纤溶酶原激活物、尿激酶受体、尿激酶受体（PLAUR；plasminogen activator）表达。值得注意的是，分叉部一个平滑肌细胞（smooth muscle cells, SMCs）亚簇比主部获得更显著的肌成纤维细胞标志物，而其他亚簇仍保持SMCs功能。
结论：具有漏斗样病变改变的区域有更明显的T细胞和巨噬细胞驱动免疫炎症反应及SMCs分化，提示在手术去除可及血栓后联合治疗干预可能有益。
关键点：该研究在单细胞水平揭示主/叶和分叉PEA标本的全面细胞组成。具有漏斗样的分叉区域有更明显的T细胞和巨噬细胞驱动免疫炎症反应和SMCs分化，然而远端或微血管重塑仍存在。

慢性血栓栓塞性肺动脉高压（chronic thromboembolic pulmonary hypertension, CTEPH）是肺动脉高压（pulmonary hypertension, PH）的一种亚型，由肺动脉（pulmonary artery, PA）阻塞所致。未解决的血栓栓塞及其病理生理机制仍需研究，CTEPH是由小血管重塑引起的慢性进展性疾病。肺动脉内膜切除术（pulmonary endarterectomy, PEA）是手术去除可及PA病变的先进治疗选择，手术从近端内膜平面开始，直至增厚纤维组织及远端段/亚段分支。完全内膜切除可清除血管树远端尾部隐藏阻塞物，但血栓纤维化闭塞背后的细胞景观和病理特征理解有限。既往研究识别了异质细胞群，但未区分主部与分叉部；Miao et al. 通过伪时序分析识别SMCs、肌成纤维细胞和免疫细胞亚群，但约20%未识别细胞；Viswanathan et al. 成功描绘相关亚簇，但信息限于分叉部。因此，研究人员对不同解剖区域开展单细胞研究。研究人员纳入10例CTEPH PEA患者和6条参考远端PA，对主部和分叉部进行单细胞转录组分析。结论提示，主部和分叉部细胞组成不同，T/NK细胞、巨噬细胞和SMCs在炎症和血管重塑中关键；分叉部漏斗样病变区域T细胞和巨噬细胞驱动免疫炎症和SMCs分化，去除近端闭塞而未处理所有远端分支会遗留显著疾病，联合治疗可能有益。该研究提供了CTEPH区域异质性图谱和治疗靶点线索。

关键技术方法不超过250字：样本来自上海肺科医院正在进行的临床研究（K18-055），纳入10例接受PEA的CTEPH患者，采集主/叶和分叉部；6条参考远端PA来自因外周小结节行肺叶切除者（非肺癌）。方法包括组织单细胞解离、单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNAseq）、原始数据比对与表达矩阵构建、质控降维聚类、差异表达分析、细胞类型注释、GO/GSVA通路富集、Monocle2轨迹、RNA velocity、CellPhoneDB细胞互作、pySCENIC转录因子网络、UCell基因集评分、OMIM/GWAS分析、H&E/Masson/EVG染色和免疫荧光。

研究结果：
2.1 不同解剖区域CTEPH组织的单细胞图谱：对60 019个主部、60 627个分叉部和36 733个参考PA单细胞分析，鉴定25个原始簇、9种细胞。与参考PA比，CTEPH内皮细胞（endothelial cells, ECs）、SMCs、成纤维细胞和肥大细胞减少，浆细胞增加。主部MPs为66% vs 54%，ECs、SMCs和浆细胞较低。OMIM分析显示ECs高表达CAV1和ENG，MPs高表达FCGR2A和F13A1，成纤维细胞富集PROS1；SMC与成纤维细胞互作增加，MPs与T/NK互作在分叉部主导。组织学显示主部肌化和纤维化血栓机化，分叉部为漏斗样和再通血管病变；Masson染色主部胶原填充，分叉部胶原与平滑肌纤维共存；EVG显示主部弹性纤维、胶原、血细胞和肌纤维丰富，分叉部胶原更多；免疫荧光显示主部成纤维细胞较高，分叉部可见成纤维细胞和SMCs。
2.2 CTEPH组织免疫 compartment 的分子特征：分析45 289个主部和41 010个分叉部单细胞，鉴定T/NK细胞、B细胞、MPs、肥大细胞、浆细胞和增殖细胞。主部T/NK比例降低而MPs增加。与参考PA比，MPs炎症基因CXCL8和IL1B上调，NK抑制标志KLRB1上调，T/NK炎症介质IL7R和B细胞CCR7上调。主部MPs的APOE和CTSB、肥大细胞CPA3较高。轨迹推断显示两个分支点，主部增殖细胞在一端富集，分叉部T/NK在相应端稳定；主部另一端浆细胞增加。GWAS分析将HLA-DPA1和DNAJC10与CTEPH易感性关联。
2.3 CTEPH样本中T和NK细胞异质性：识别CD4初始T细胞、CD8初始T细胞、CD8效应T细胞（Teff）、NK细胞和NKT细胞。参考PA中CD8 Teff和NK细胞占优，CTEPH中CD8初始T和CD4初始T显著增加。分叉部NK比例减少，主部NK维持。CTEPH中NK和CD8 Teff高表达XCL2、IL32、ANXA1和ISG15；CD8 Teff缺乏MT1E、MT2A、GZMH和GZMB，CCR7增加。主部CD8初始T高表达免疫球蛋白基因IGKC、IGHG1、IGHG4、IGLC2，NK的NCR1和KLRC1降低。主部CD4初始T的TXNIP、CD8初始T的IL32增加，CD8 Teff的MGP和NK的NKG7降低。TNF–TNFRSF和FAS–FASLG互作在参考PA和CTEPH中突出，主部减少；分叉部NK仅通过TNFSF14和TNFRSF1A与CD4初始T通讯。
2.4 分叉部具有炎症谱的巨噬细胞：鉴定7个巨噬细胞亚簇。亚簇2高表达IL1B和TNF、低IL6，为M1样；亚簇1高表达MRC1和CD163、几乎无IL1B或TNF，为M2样。主部M1样增加，M2样减少。分叉部和主部M1样高表达FN1、VCAN和TIMP1，OLR1和IL1B降低；分叉部M2样高表达PLAUR和SELENOP。伪时序和BEAM显示趋炎症谱CXCL1/2/8、CCL3、IL1B和CCL3L1。HALLMARK显示分叉部巨噬细胞炎症反应、血管生成、上皮-间质转化（epithelial–mesenchymal transition, EMT）和TGFβ信号上调。GO显示分叉部M2样富集免疫反应激活和淋巴细胞增殖，M1样富集脂多糖反应和细胞因子产生。免疫荧光显示PLAUR定位于分叉区巨噬细胞周围。
2.5 CTEPH中平滑肌细胞向肌成纤维细胞转变：鉴定7个SMC簇（SMCs_1–5）、1个成纤维细胞簇和1个肌成纤维细胞簇。CTEPH中肌成纤维细胞和成纤维细胞增加，SMCs减少。差异表达显示SMC簇异质性，共享POSTN、FN1、COL1A1和LUM等成纤维标志。伪时序显示从SMCs经成纤维细胞到肌成纤维细胞的轨迹，CTEPH中SMCs_2向成纤维细胞和肌成纤维细胞转变。SMCs_2沿伪时序变化最大，获得LUM、FN1和POSTN。RNA velocity确认CTEPH中SMCs_2到肌成纤维细胞的分化连续，参考PA未见。GO显示SMCs_2的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）组织和细胞外结构组织上调，血管发育、血管生成和SMC增殖下调。免疫荧光确认LUM和POSTN在SMCs中表达，分叉部比主部更明显共定位。

讨论部分总结：手术去除PA阻塞可治愈部分CTEPH，但许多患者不适合手术。该研究提供CTEPH细胞组成及不同解剖区域基因表达改变，揭示主部与分叉部差异，包括SMC向肌成纤维细胞转变、巨噬细胞和T细胞驱动炎症；提示仅去除近端闭塞而不处理所有远端分支会遗留显著疾病。既往研究未区分主部和亚段部，且基于有限标记。该研究识别CD8 Teff和NK细胞促炎症，主部初始T细胞促免疫失调。不同区域病理不同：主部为肌化和纤维化血栓，远端叶/段PA阻塞呈粥样或漏斗样病变，小肌性PA重塑类似特发性肺动脉高压。PEA可处理主PA和叶支，但远端或微血管重塑仍存在，PH靶向治疗在可手术患者PEA后的作用需探索。与分叉部比，主部T/NK减少；CD8⁺ Teff在分叉部炎症激活，主部初始T细胞免疫失调。既往将PEA材料作为均一实体，该研究引入个体内区域比较，揭示不同解剖区T细胞功能状态相反。初始CD8⁺ T细胞激活可分化为效应细胞，抗原清除后形成记忆T细胞；慢性条件下T细胞可能耗竭并促进疾病进展。CD8⁺ Teff招募触发趋化因子和细胞因子，吸引内源淋巴细胞。分叉部CD8⁺ Teff维持炎症招募，初始T细胞更多，提示其参与起始炎症和血管重塑，可能为治疗靶点。M1/M2分类虽简化但广泛用于描述巨噬细胞多样性。伪时序显示M1样增加，M2样稳定；PLAUR作为巨噬细胞黏附和迁移关键调控因子，需用scRNA-seq探索巨噬细胞表型多样性。SMC异质性类似动脉粥样硬化，从收缩表型向分泌表型转变并产生过多ECM。该研究特定SMC簇获得VIM、POSTN和FN1，RNA velocity提示SMC到肌成纤维细胞连续，GO显示收缩特征丧失。肌成纤维细胞形成可能参与血栓机化；分叉部炎症T细胞和巨噬细胞促进SMC转肌成纤维细胞，靶向SMC表型转换可能是未来CTEPH治疗探索方向。局限性包括：关注主和段/亚段PA，可能不反映小血管；按解剖区分离但无法按切片数标准化；队列小且无独立验证，区域细胞异质性与术前血流动力学、治疗反应或PEA后预后关系未明；需空间转录组和多重成像进行功能验证；无动物或体外功能实验，因果作用仍推测；未关联细胞谱效用。

研究结论翻译：总之，该研究利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）表征CTEPH不同解剖区域的细胞异质性，探索不同解剖区域免疫和血管细胞异质性。研究结果表明，CTEPH病变主部和分叉部具有不同细胞组成，T和NK细胞、巨噬细胞和SMCs在炎症和血管重塑中起关键作用。这些结果突显CTEPH发病机制的复杂性，并提示靶向特定细胞通路，如SMC向肌成纤维细胞转变和T细胞募集，可能提供新的治疗机会。