《Clinical and Translational Medicine》：Spatiotemporal transcriptomics for tumour microenvironment remodelling in cancer progression and therapy
背景：时空转录组学（spatiotemporal transcriptomics, STT）将空间分辨的基因表达与来自分期样本、配对治疗标本或计算推断的时间信息整合，为重建组织水平动态提供框架。在肿瘤微环境（tumour microenvironment, TME）中，STT通过揭示肿瘤演化过程中细胞邻域和功能生态位如何重组，扩展了静态分子与细胞图谱。正文：本综述考察STT如何表征恶性转化、侵袭、转移、衰老和治疗反应过程中的TME重塑。研究人员讨论解析时间动态的策略，包括分期分层采样、配对或系列标本、伪时间（pseudotime）与轨迹推断（trajectory inference），以及互补的活体成像（intravital imaging）。研究人员进一步考虑时空分析如何将细胞状态、空间组织和细胞间相互作用的变化与临床相关肿瘤表型联系起来。结论：通过将TME空间组织与分期和治疗相关分子变化联系起来，STT可能改善候选靶点优先级、治疗分层和精准肿瘤学策略的开发。
1 INTRODUCTION
肿瘤微环境（tumour microenvironment, TME）是共同演化的生态系统，其空间组织与时间可塑性同肿瘤进展和治疗反应密切相关。TME包含缺氧、血管周围和转移前生态位（pre-metastatic niches, PMNs）等功能性空间生态位，随疾病进展和治疗干预持续重塑。传统bulk转录组平均化组织区域信号，解离单细胞RNA测序丢失空间背景；常规空间转录组多代表单时间点。时空转录组学（spatiotemporal transcriptomics, STT）整合不同疾病阶段、原发与转移灶或治疗时间点的空间转录组谱及计算推断，重建时间有序变化。由于空间转录组测序通常具破坏性，当前STT多不连续追踪同一细胞或区域，而通过独立分期样本、配对治疗前后标本或轨迹分析重建时间关系。活体成像（intravital imaging）提供直接时间观察，STT提供更广分子覆盖，二者互补。本综述将STT定义为推断框架，区分直接纵向观察与基于分期样本、系列标本或计算状态排序重建的时间关系。
2 OVERVIEW OF TME
2.1 Tumour cells
肿瘤细胞具遗传和表观遗传异质性，与微环境动态互作，影响肿瘤起始、转移和治疗反应。转移起始细胞经上皮–间充质转化（epithelial–mesenchymal transition, EMT）获得侵袭能力，进入循环并定植远处器官；播散肿瘤细胞可休眠，后在免疫抑制微环境建立后重新激活，过程具时空背景依赖性。
2.2 Immune cells
随肿瘤进展，TME从免疫监视转向免疫抑制。早期肿瘤或侵袭边缘自然杀伤（natural killer, NK）细胞和效应T细胞相对活跃；缺氧区扩大后功能耗竭并局限于肿瘤核心。肿瘤细胞上调免疫检查点并促进调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）浸润。树突状细胞（dendritic cells, DCs）在持续炎症和代谢应激下趋于未成熟，抗原提呈能力下降。肿瘤相关巨噬细胞（tumour-associated macrophages, TAMs）早期以促炎M1样为主，后向免疫抑制M2样转变。髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）随进展增加，富集于缺氧区、侵袭前沿、血管周围区域和PMNs，抑制细胞毒性T细胞和NK细胞，并促进Treg扩增、血管生成、ECM重塑和PMN形成。
2.3 Extracellular matrix
肿瘤细胞通过可溶性因子和直接接触调节非恶性细胞，驱动细胞外基质（extracellular matrix, ECM）结构重塑。癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）通过ECM重塑影响迁移和侵袭，并通过调节T细胞空间分布和功能状态塑造局部免疫反应；其功能状态随空间区域和疾病进展动态变化。
2.4 Vascular system
TME中血管重塑为肿瘤提供营养和生长因子，抑制抗肿瘤免疫并促进生长、侵袭和转移。早期血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）等促血管生成因子上调，血管密度增加。淋巴系统维持液体平衡和免疫监视，但肿瘤组织中淋巴管异常重塑，损害引流，促使肿瘤细胞经淋巴管迁移至区域淋巴结并形成转移灶。
2.5 Signalling molecules and metabolic products
TME信号分子包括VEGF、肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α, TNF-α）、干扰素、黏附分子等，调节免疫和细胞间黏附。PD-L1等免疫抑制分子帮助免疫逃逸。缺氧诱导异常代谢，乳酸、氨和脂质积累，改变酸碱平衡、氧化还原和营养供应；高浓度乳酸酸化TME，促进侵袭和转移。氨基酸代谢改变和核苷酸代谢增强也影响进展。
2.6 Functional niches in the TME
功能生态位是具特定细胞组织、通讯网络和分子特征的多细胞区域，包括缺氧生态位、血管周围生态位、免疫排斥生态位、侵袭前沿生态位、CAF富集基质生态位、三级淋巴结构（tertiary lymphoid structure, TLS）样免疫枢纽和PMNs。缺氧生态位含HIF驱动肿瘤细胞、抑制性巨噬细胞、MDSCs、异常血管、乳酸和ECM重塑；侵袭前沿含EMT样肿瘤细胞、CAFs、TAMs、MDSCs和趋化因子梯度；免疫排斥生态位以细胞毒性淋巴细胞滞留于基质边界、致密ECM、抑制性髓系细胞和TGF-β或CXCL12–CXCR4轴为特征；血管周围生态位调节氧输送、免疫细胞运输和治疗可及性。
3 STT TECHNOLOGIES AND APPLICATIONS
3.1 Fundamental principles of STT
STT源于空间转录组学，在完整组织中定位和定量RNA。技术分为基于测序的空间转录组学（sequencing-based spatial transcriptomics, SST）和基于成像的空间转录组学（imaging-based spatial transcriptomics, IST）。SST平台如Visium、Slide-seq和Stereo-seq覆盖较广，适合识别空间域和多细胞组织，但有效细胞分辨率受捕获效率、组织质量、测序深度和反卷积或分割影响。IST可实现单细胞或亚细胞定位，但多依赖预设基因panel，增加靶基因数会提高成像时间、数据量和分析复杂性。平台选择需在分辨率、灵敏度、基因覆盖、组织面积、通量和成本间权衡。STT与纵向活体成像互补：后者时间连续性强但分子覆盖有限，前者分子深度高但通常破坏性采样。
3.2 Temporal inference and analytical workflow
STT流程应区分空间数据预处理和时间关系推断。质控、配准、分割或spot反卷积和细胞状态注释后，时间证据可通过有序分期样本、配对或系列治疗标本、伪时间（pseudotime）或轨迹推断、RNA velocity或代谢标记等策略引入，这些策略支持不同水平推断。STT轨迹推断需考虑空间坐标、邻域结构、组织边界和截面变形；空间邻近不一定代表谱系，伪时间应解释为相对状态排序。多样本整合需几何配准和批次校正，评估应同时关注批次混合及组织学域、细胞状态多样性、空间邻域和已知阶段或治疗效应的保留。细胞–细胞通讯分析应在空间和时间建模之后，CellChat和CellPhoneDB等推断的配体–受体对应视为假设生成信号。
3.3 Experimental designs and application boundaries
分期分层横断面队列可识别阶段差异空间程序；配对或系列标本可将重塑与治疗或进展关联；伪时间或velocity可产生状态转换假设。这些设计均不能单独证明连续细胞追踪，研究人员应区分空间差异与推断轨迹，并将因果语言保留给实验验证机制。STT尤其适合研究功能生态位重组而非仅细胞丰度变化。分析应整合细胞组成、组织结构、空间可变通路、邻域结构和时间有序采样。FFPE归档队列扩大材料可及性，但回顾性采样引入固定、RNA质量等变异，需生物重复、协调采样、病理引导区域选择和独立验证。
4 APPLICATIONS OF STT IN THE TME
4.1 STT in the characterisation of spatial heterogeneity in the TME
4.1.1 Intercellular interactions
STT保留空间背景，可映射细胞邻域、邻近关系和候选通讯程序。配体–受体分析多由转录共表达和空间邻近推断，应视为空间支持假设。宫颈癌发生中上皮–免疫通讯从保护性向免疫调节和恶性生态位形成逐步转变；前列腺癌中低级别肿瘤也可建立免疫抑制微环境，CCL20–CCR6可能介导髓系–Treg通讯，内皮和血管周围细胞显示血管生成程序。
4.1.2 Spatial localisation and dynamic regulation of key signalling pathways
STT可将通路活性定位到特定细胞群和生态位。肝细胞癌侵袭前沿中，CXCL6激活邻近肝细胞JAK–STAT3，诱导SAA1和SAA2，经TLR2/FPR1招募并极化M2样巨噬细胞，形成免疫抑制生态位。胰腺上皮内瘤变和胰腺导管腺癌中，低级别向高级别PanIN进展伴TFF1增加和炎症向增殖信号转变，并与特定CAF亚型和癌症干细胞样细胞空间出现相关。
4.1.3 The spatial characteristics of tumour boundary maintenance
肿瘤边界是侵袭、转移和微环境重塑的关键界面。STT可分析边界细胞结构、通讯和功能转变。乳腺癌中“border cells”共表达两个腔室标志并富集侵袭和干性相关基因如CX3CL1、CCL28、PROM1和KLK5；结直肠癌中肿瘤细胞在侵袭前沿积累。STT还可识别“margin invasive niches”等肿瘤边缘EMT相关空间生态位，提示边界是上皮可塑性、ECM重塑和免疫调节汇聚的主动过渡区。
4.2 Dissecting the temporal dynamic changes of the TME via STT
4.2.1 Temporal evolutionary analysis of tumour invasiveness
STT支持跨阶段空间基因表达整合。口腔黏膜配对活检显示，从正常、口腔白斑伴中重度异型增生到早期T1口腔鳞状细胞癌，上皮肿瘤起始程序逐渐富集，并形成基质–免疫生态位；Mesen_CAFs邻近上皮，CXCL12–CXCR4和WNT5A–FZD6可能支持增殖、基质重塑和免疫招募。前列腺癌中，Club样上皮细胞与低雄激素信号、炎症、管腔祖细胞样特征和SASP相关，与PMN-MDSC活性增加相关，CCL20–CCR6富集于Club–免疫界面。
4.2.2 Dynamic remodelling of the immune microenvironment: Fostering immunosuppression and immune evasion
STT可表征治疗下免疫重塑。结直肠癌肝转移配对新辅助化疗（neoadjuvant chemotherapy, NAC）样本中，治疗前富集MRC1
+CCL18
+ M2样巨噬细胞；应答者中该亚群下降并伴GZMK
+XCL1
+细胞毒性CD8
+ T细胞扩增，非应答者免疫抑制持续或加剧。PMN中，NU
highepi细胞与成纤维细胞和内皮细胞共定位，表现干性、迁移和免疫逃逸增强，可能参与转移许可生态位。
4.2.3 Temporal evolution of metabolic adaptation in the TME
肿瘤通过重编程周围细胞代谢适应营养缺乏，重塑TME代谢景观。结直肠癌中NU
highepi细胞与基质和内皮互作，COL1A1/COL1A2–ITGB1连接基质重塑，NME1为潜在转移抑制因子。口腔鳞状细胞癌中，肿瘤来源乳酸通过HIF1A中心代谢–信号–免疫调节轴塑造TME重塑，提示代谢重编程与免疫抑制空间协调。
4.2.4 Temporal analysis of tumour drug resistance mechanisms
STT可映射耐药相关程序及细胞空间关系。染色体碎裂型SHH髓母细胞瘤中，耐药呈多克隆起源和空间异质性，复发肿瘤由多个遗传克隆空间共存驱动，经肿瘤微管协同传递钙信号增强抵抗，Midkine通路激活加剧耐药。EMT和循环肿瘤细胞（circulating tumour cells, CTCs）与抵抗相关；STT可连接EMT可塑性与空间结构，识别限制侵袭、转移和耐药的脆弱生态位。
4.2.5 Remodelling and reconstruction of the TME during the aging process
系统性衰老是癌症主要风险因素，影响具阶段依赖性。衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）是衰老细胞影响微环境的关键机制。颅咽管瘤中SASP阳性细胞分布于栅栏状上皮和胶质区域，建立局部衰老微环境，伪时间建模显示PI3K/Akt/mTOR、MYC和Hedgehog通路激活及p53信号减弱。乳腺组织中，年轻和老年小鼠显示年龄相关细胞状态变化，空间转录组提示老年免疫标志物在epithelial区域附近共现增加，以及整合素和Jag1–Notch信号线索。
4.3 STT drives precision oncology
4.3.1 Mining cellular and molecular targets based on spatiotemporal dimensions
STT保留空间背景，可依据表达、空间定位、细胞类型特异性、生态位关联和阶段变化优先候选靶点。候选分子在侵袭前沿、免疫排斥区、血管周围生态位或耐药簇中富集并与一致信号程序关联时更具信息。此类候选应视为空间支持假设，需正交和功能验证。STT可重建TME内基因调控网络和信号通路，促进背景特异性治疗靶点识别。
4.3.2 Spatial context and temporal dynamics of representative candidate targets and pathways
候选靶点相关性随进展和治疗改变。BRAF突变黑色素瘤中，多时间点空间转录组显示耐受群体增殖降低、氧化磷酸化增加和侵袭增强，中央与周围区域存在空间差异；DUSP4等MAPK反馈调节因子呈谱系和阶段依赖模式，多时间点分析突出MAPK反馈调节为适应和耐药中相关性变化的候选过程。
4.3.3 Genetic and epigenetic regulation and functional validation of spatially characterised candidate targets
空间候选靶点需功能和调控验证。胰腺导管腺癌中，CD276/B7-H3因化疗后增加并定位于含SNCG
+基底样肿瘤细胞、SPP1
+巨噬细胞和耗竭T细胞的耐药生态位而被优先考虑；CRISPR–Cas9敲除增强CD8
+ T细胞杀伤，B7-H3阻断使恶性程序远离基底样状态。Group 3髓母细胞瘤中，单核RNA和ATAC分析及空间验证发现祖细胞样耐药状态，H3K4me3、H3K27ac和H3K27me3景观改变，IDH1抑制部分逆转耐药相关染色质变化并增加放射敏感性。
4.3.4 Immunotherapy optimisation: Targeting the spatiotemporal dynamics of the immune microenvironment
STT可比较治疗前后TME。TLS分析显示肿瘤细胞通过增强色氨酸代谢诱导TLS未成熟并抑制局部免疫，抑制该通路促进TLS成熟并与抗PD-1治疗协同。皮肤鳞状细胞癌中，肿瘤特异性角质形成细胞位于肿瘤边缘，与Tregs、CD8
+ T细胞和表达PD-L1/PD-L2的DCs形成纤维血管生态位；ITGB1和PLAU等高表达与免疫治疗抵抗和不良预后相关。
4.3.5 Spatiotemporal analysis applications in personalised treatment strategies
整合STT与单细胞测序可改善患者分层。STT可比较正常、癌前、早期和晚期组织，识别早期检测候选标志物，并比较原发瘤与转移灶空间异质性。原发瘤中CC1和CC5生态型富集肌成纤维细胞、免疫抑制巨噬细胞和Tregs，提示抗纤维化或CAF靶向联合；肝转移CC3以高增殖和糖酵解为特征，提示代谢干预；侵袭边缘CC7含CD8
+ T细胞、M1样巨噬细胞和Tregs，可能对免疫检查点抑制剂响应。但许多STT衍生靶点证据仍初步，仅少数纳入直接功能验证。
5 NEW DIRECTIONS IN STT RESEARCH
5.1 Innovative advances in technology and data analysis methods
3D空间转录组可将2D数据扩展为3D重建，结合组织透明化、连续切片和图像配准，实现器官水平分子谱分析。Open-ST支持高分辨率空间转录组和3D组织重建，SANTO支持切片对齐和拼接，可改善肿瘤–基质界面、免疫屏障、血管和转移路径重建。整合scRNA-seq可改善细胞注释和罕见状态定位；整合基因组、表观基因组、蛋白质组、代谢组和免疫组可提供全面视图。转移性肝细胞癌多组学显示缺氧富集原发瘤早期多克隆播散、体细胞拷贝数改变驱动转移、免疫逃逸和HLA-E–CD94-NKG2A轴介导CD8
+ T细胞耗竭。
5.2 Algorithm improvement
未来算法应伴随标准化、可重复流程，涵盖质控、空间域识别、细胞注释、轨迹推断、通讯分析、多样本整合和验证，并定义最低报告要求。轨迹分析应整合转录状态、空间组织和采样阶段，进行敏感性分析。通讯分析应走向空间组织信号程序识别，纳入邻域、腔室、边界和信号范围。多样本整合和批次校正对跨患者、阶段、治疗和平台研究重要；现有方法多来自scRNA-seq，未充分建模空间架构和时间排序。3D重建和多组学整合需标准化配准、质量评估、分辨率匹配和部分重叠特征整合。
5.3 Clinical application
未来临床研究应超越描述性图谱，用STT解决治疗反应、耐药和生物标志物问题。免疫治疗中，前瞻性分析治疗前、治疗中和进展样本可表征肿瘤–免疫界面、免疫排斥区、TLS和耗竭T细胞状态变化，支持空间特征开发。临床转化需前瞻性充分把握度队列、标准化采样、多区域采集、病理注释和生存数据整合。空间生物标志物应在独立多中心队列验证，并需简化低成本检测用于常规病理评估。
6 CRITICAL VIEW
多数当前研究仍为探索性，时间信息常从横断面数据间接推断而非真正纵向采样，肿瘤起始、进展、转移和治疗反应动态仍未完全解析。技术因素如样本制备、通量、分辨率、分割准确性、批次效应和计算推断限制可重复性。尽管如此，STT结合广分子谱与保留组织结构，将分子程序分配至特定细胞群、邻域、组织学边界和功能生态位。纵向活体成像可同细胞追踪但分子覆盖有限，STT通常不能连续追踪同一细胞但提供更广空间分子信息，二者应整合。CellChat和CellPhoneDB等通讯推断未充分考虑空间邻近和组织结构，应视为假设生成信号。整合STT与系统级分析框架可能为空间解析研究肿瘤演化、微环境重塑和治疗相关适应提供机会。
