利用标记辅助技术将叶锈病抗性基因LrM从Ae. markgrafii的衍生品ER9-700转移到小麦品种HD2967中

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Marker-assisted transfer of leaf rust resistance gene LrM from Ae. markgrafii derivative ER9-700 to wheat variety HD2967

　　摘要
影响小麦的最重要疾病之一是叶锈病，在严重感染的情况下，可能导致产量损失高达50%。此前在Ae. markgrafii渐渗系（IL）ER9-700中鉴定出一种新的叶锈病抗性基因LrM，并通过基于SSR和SNP的PCR标记将其定位在2AS染色体上。我们当前的研究目标是将LrM转移到广泛使用的商业小麦品种HD2967中。HD2967于2011年在印度西北部和东北部平原地区推出，但在更大范围内种植后变得容易受到叶锈病的侵袭。将供体亲本ER9-700与HD2967杂交以产生F1代植株，然后将F1代与重复亲本（RP）HD2967回交以产生BC1F1和BC2F1代。在每一代回交中都进行了前景选择、背景选择和表型选择，以选出携带LrM且表型与RP相似的植株。LrM的前景选择使用两个共分离的分子标记SNP_AX-945380402AS和SNP_AX-945219402AS进行，而背景选择则使用分布在小麦21条染色体上的SSR标记进行。在BC2F3代中鉴定出了纯合的LrMNIL（ NILs），这些NILs携带超过95%（95.57%-96.90%）的重复亲本基因组（RPG）。使用叶锈病77-5致病型对BC2F3代进行表型分析，也证实了这些NILs的抗性基因纯合性。细胞学稳定性测试表明，这些NILs不会因Ae. markgrafii的致死基因而表现出不育。为了鉴定出更优质的NILs，还记录了六个NILs的农艺形态特征。除一个NIL（HD2967+LrM NIL-5）外，其余NILs要么与RP HD2967相当，要么优于RP HD2967。优质的NILs可以在多地点测试后作为新品种推出，或作为叶锈病抗性基因LrM的来源用于未来的育种计划，也可以与HD2967背景中已有的其他抗性基因结合，以提高品种的持久性。

1. 引言
小麦是全球种植最广泛的谷物之一，为近四分之一的人口提供主食[1]。在全球小麦总产量方面，印度排名第二，仅次于中国。2024-25年度，印度在3276万公顷的种植面积上生产了1.175亿吨小麦，平均每公顷产量约为3.56吨[2]。随着人口的持续增长，迫切需要提高小麦产量，因为据估计到2050年需要比当前水平增加40%的产量[3]。这一任务因全球变暖和气候变化等威胁而变得更加复杂，这些因素引发了新的生物和非生物胁迫，给提高整体产量带来了更大挑战。小麦会受到多种生物和非生物胁迫的影响，从而导致产量减少。在生物因素中，锈病是一个显著的威胁，具有重大的经济影响。由Puccinia triticina引起的叶锈病是小麦最重要的疾病之一，在严重情况下可导致产量减少50-60%[4,5]。这种病害在印度各地都有发生。尽管有化学控制方法可以对付锈病，但开发抗锈病品种是减轻这些病原体造成的经济损失的最有效策略之一。迄今为止，已鉴定出100多个抗叶锈病的基因，其中85个已被正式命名[6]。在早期的育种项目中，许多这样的抗叶锈病基因已被转移到小麦品种的遗传背景中。成功的基因导入例子包括Lr10、Lr13、Lr19、Lr24、Lr26、Lr28、Lr31、Lr34、Lr37、Lr57和LrTrk[7][8][9][10][11][12][13][14][15][16][17]。新的抗性基因不断出现，而病原体也在进化，导致早期有效的抗性措施变得失效[18]。新的强毒叶锈病菌株已经出现，能够克服小麦品种中的抗性基因。例如Lr9[19]、Lr19[20]、Lr28[21]、Lr13、Lr24、Lr26和Lr37[22]，这使得小麦对叶锈病的易感性增加[23]。因此，必须不断寻找新的抗性来源并加以应用，以应对新出现的菌株[24,25]。不同的野生种及其近亲携带大量对经济有重要意义的抗性基因。携带叶锈病抗性基因的Aegilops物种已被商业化利用，以保护小麦免受锈病造成的损失[26]。小麦的第三基因库被认为是未被充分开发的宝贵资源，其中包含多种抗多种胁迫的宝贵基因。虽然从第一和第二基因库中的物种转移基因相对简单，但从第三基因库进行渐渗育种则较为复杂，通常需要使用染色体操作技术[27]。Ae. markgrafii (Greuter) Hammer（同义词Ae. caudata L.，2n = 2x = 14，基因组CC）是一种属于第三基因库的二倍体非祖先物种，是抗锈病和其他几种重要小麦病害的潜在抗性来源[28][29][30]。通过5B零体染色体制法诱导小麦和Ae. markgrafii染色体之间的配对，并进一步进行回交和自交，培育出了携带新广谱抗性基因LrM的渐渗系ER9-700[31]。随后使用三个共分离标记SNP_AX-948171722AS、SNP_AX-945380402AS和SNP_AX-945219402AS将LrM定位在小麦的2AS染色体上，距离约为2 cM[31]。ER9-700的表现型和LrM的染色体位置表明，该基因具有新颖性，如果将其引入小麦育种计划，将拓宽叶锈病抗性的遗传基础。考虑到病原体的持续进化和育种者需要有效的基因，我们使用标记辅助回交将LrM抗性基因从ER9-700转移到HD2967品种中。HD2967是2011年在印度推出的一个主要品种，在西北部和东北部平原地区广泛种植，推广后很快占领了超过1000万公顷的土地[32]。尽管该品种容易受到所有类型锈病的影响，但仍受到农民的青睐。

2. 材料与方法
2.1. 植物材料和分子标记
本研究的植物材料包括全国广泛种植的小麦品种HD2967（作为受体亲本）和来自Ae. markgrafii的渐渗系ER9-700（作为供体亲本，提供叶锈病抗性）。选择了三个共分离标记SNP_AX-945380402AS和SNP_AX-945219402AS用于LrM抗性基因的前景选择。大约1200个SSR标记分布在小麦的21条染色体上，用于评估亲本多态性，这些多态性标记也用于背景选择。
2.2. 通过标记辅助回交将LrM从ER9-700转移到HD2967
重复亲本HD2967与Ae. markgrafii衍生的ER9-700杂交产生F1代。F1代植株与重复亲本HD2967回交，产生BC1F1代。在BC1F1代中使用LrM的共分离标记进行前景选择，确定携带该基因的植株。进一步选择与重复亲本HD2967表型相似的植株。选择五个携带LrM抗性基因且表型与RP HD2967相似的植株进行背景选择。将携带最多重复亲本基因组（RPG）的植株与HD2967回交，产生BC2F1代。在BC2F1代中再次进行前景选择、表型选择和背景选择。将携带最多RPG的植株自交，产生BC2F2代。在BC2F2代中再次进行前景选择和表型选择，以鉴定出携带LrM的植株。将携带LrM的植株自交，产生BC2F2后代。在BC2F3代中继续进行前景选择和叶锈病抗性表型分析。选择在两个标记上都呈纯合状态的BC2F2后代，并进一步鉴定其与RP HD2967的表型相似性。选择六个与HD2967最相似的NILs，在新德里IAR的田间条件下记录其农艺形态特征。标记辅助回交方案如图1所示。RPG%的计算使用Mallick等人提供的标准公式[9]。

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图1. 用于开发NILs（HD2967+LrM）的标记辅助回交方案。其中，FS表示前景选择；PS表示表型选择；BS表示背景选择。
2.3. 对BC2F2后代的叶锈病抗性表型评估
使用P. triticina病变型77-5（印度最流行和强毒的致病型之一），对BC2F2后代或BC2F3代及其对照品种RP HD2967、DP ER9-700和易感品种Agra Local进行叶锈病抗性筛选。初始接种物来自ICAR-Indian Institute of Wheat and Barley Research（IIWBR）的区域站点Flowerdale（西姆拉），并在ICAR-IARI（新德里）的易感小麦品种Agra Local上扩增以供进一步使用。在遗传学部门的温室中，将BC2F3代的25个品系、亲本系和对照品种各种植15粒种子，种植在4×10×3英寸的铝盘上。将10天的幼苗用喷雾器喷洒接种物进行接种。接种混合物由水和一滴Tween 20配制而成。接种后，将托盘放在湿润的玻璃箱中48小时，随后转移到温室中的光照和温度条件下。接种12天后，根据Stakman等人的方法记录锈病反应（感染类型）[33]。
2.4. 基于分子标记的分析
根据Murray和Thompson的方法[34]，从14至21天的幼苗中收集叶片样本进行DNA提取。使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检查DNA纯度，并使用NanoDrop?分光光度计进一步定量。将DNA样品稀释至最终浓度25 ng/μL，然后进行PCR扩增。使用两个与LrM共分离的SNP标记SNP_AX-945380402AS和SNPAXB-945219402AS进行前景选择。使用分布在小麦三个基因组上的1200个SSR标记进行亲本多态性分析，这些多态性标记也用于背景选择。PCR反应使用1 μL正向引物和反向引物、3 μL 2x GoTaq PCR Master Mix（Promega，#M7122）、3 μL无核酸酶水和2 μL基因组DNA（25 ng）在96孔PCR板中进行。PCR反应的标准热循环程序如下：初始变性步骤为94°C 4分钟，随后是35个循环，每个循环包括94°C 30秒、50°C-60°C范围内30秒的引物退火、72°C 30秒的延伸，最后在72°C下延伸10分钟以确保目标片段的完全扩增。表1提供了用于前景选择的SNP标记的PCR扩增谱型。PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶上电泳分离，并使用UV透射凝胶成像系统（G: Box，Syngene）进行可视化。RPG%的计算公式如下：
????????% = (检测到的重复亲本纯合位点数 + 1) / (总杂合位点数 + 2 × (评分的多态性标记总数) × 100
表1. 与LrM共分离的SNP标记的详细信息
| SNP标记 | 正向引物 | 反向引物 | PCR条件 |
|-----------------|--------------------|------------------|-------------------|
| SNP_AX-945380402AS | GTA GAA CAA AGA GGT TGT CTGC | 94°C 4分钟；35个循环（94°C-30秒, 60°C-30秒, 72°C-30秒；72°C-10秒） |
| SNP_AX-945219402AS | ATG CAA GCA GAA CCA AGT TGTGACA CCG TAC TAG CCA CCA GAGT | 94°C 4分钟；35个循环（94°C-30秒, 60°C-30秒, 72°C-30秒；72°C-10秒） |
2.5. NILs（HD2967+LrM）的细胞学分析
通过计数减数第一次分裂期的二价体和单价体数量，分析了六个近等基因系的细胞学稳定性。由于供体系ER9-700携带了来自Ae. markgrafii的CC基因组中的基因片段，而该基因组已知含有杀配子基因[35]，因此研究这些近等基因型（NILs）的细胞稳定性非常重要。CC基因组上的杀配子（Gc）基因被称为自私遗传元件，它们会导致携带Gc基因的配子优先传递，同时缺乏这些基因的配子会发生染色体断裂和不育。之前，Rani等人[31]对用于开发ER9-700的ER9进行了细胞学分析，发现其细胞学上是稳定的，含有21个二体。但在将这些NILs用于品种改良之前，需要确认它们的细胞稳定性。为此，在抽雄期从NILs中收集了适当大小的未成熟小穗。识别出含有减数第一次分裂中期花粉母细胞（PMCs）的雄蕊，用Carnoy固定剂固定后储存在4°C下。为了制备载玻片，将雄蕊在1N HCl溶液中于60°C下水解12分钟，然后用Feulgen溶液在暗处染色。随后，使用挤压法制备载玻片，并使用2%的acetocarmine溶液进行染色。

2.6. 对NILs的农艺形态特征的评估
遵循所有推荐的实践程序，在新德里的印度农业研究所的农场中，采用随机完全区组设计对六个NILs及其回交亲本HD2967进行了农艺形态特征的评估，重复两次。每个区组中，每个样本种植在两行中，每行至少15株植物。记录了每个NIL的多个农艺形态特征的数据，包括植株高度（厘米）、每株植物的有效分蘖数、穗长（厘米）、每穗的小穗数、每穗的籽粒数和千粒重。数据使用在线统计分析工具OPSTAT进行分析。这一初步的NILs评估有助于识别出适合站内和多点试验的优良NILs。

3. 结果
3.1. 利用标记辅助回交技术开发携带叶锈病抗性基因LrM的NILs
通过将亲本杂交产生的F1代植株与回交亲本HD2967进行回交，产生了250粒BC1F1种子。在BC1F1代中，前期选择出了130株携带LrM的植株，而120株不携带LrM。通过χ2分析测试了观察到的标记分离比，数据显示分离比为1:1（χ2 = 0.4，P = 0.52，自由度为1）。在这130株植物中，根据与HD2967的表型相似性选出了5株用于背景选择。通过ER9-700和HD2967之间的亲本多态性调查，共识别出113个多态性标记用于背景选择（表2）。BC1F1代中的5株植物显示出78.51-80%的背景恢复率。将携带最高RPG%（80%）的植株与HD2967进行回交，产生了150粒BC2F1种子。使用LrM标记进行前期选择，识别出77株基因阳性植株和73株基因阴性植株。再次使用χ2分析测试观察到的标记分离比，数据显示分离比为1:1（χ2 = 0.106，P = 0.74，自由度为1）。从77株基因阳性植株中再次选出了5株用于背景选择。这些植物的RPG恢复率为88.88-92.59%。将携带最高RPG%（92.59%）的植株自交，产生了BC2F2代。共筛查了75株BC2F2植株，使用共分离标记识别出56株LrM阳性植株和19株LrM阴性植株。对BC2F2代中观察到的标记分离进行卡方分析，结果显示分离比为3:1（χ2 = 0.004，P = 0.94，自由度为1）。通过表型选择，选出25株基因阳性植株进入BC2F3代。在BC2F3代中，后代行用叶锈病病理型77-5进行检测，并同时用标记检测其纯合性。有12行对标记和锈病表型均为纯合。由于我们在BC2F3代中只培养了选定的基因阳性植株的后代行并进行了标记和锈病表型检测，因此预计BC2F3代不会出现适当的分离比，因此没有进行卡方检验，也没有在表3中报告。所有12株纯合NILs都被种植在田地里，其中又有6株根据表型被选出来用于背景选择、细胞学分析和农艺形态特征的记录。这6株NILs的背景恢复率超过了95%（95.57-96.9%）（表3）。图2展示了一张代表性凝胶图像，显示了纯合抗性（HR）BC2F2后代行及其亲本（HD2967和ER9-700）中两个共分离标记的扩增情况。

表2. 用于背景选择的多态性标记列表。标记详细信息可访问：https://graingenes.org。
| 序号 | 染色体 | 标记 |
| ---- | ---- | -------- |
| 1 | AWMC6 | 11 |
| 2 | Barc7 | 13 |
| 3 | BARC1 | 14 |
| 4 | AWMC9 | 15 |
| 5 | BGWM | 16 |
| 6 | BGPW | 17 |
| 7 | AWMC7 | 18 |
| 8 | DCFD | 19 |
| 9 | AWMC2 | 20 |
| 10 | BGWM | 21 |
| 11 | AWMC7 | 22 |
| 12 | BGPW | 23 |
| 13 | AWMC7 | 24 |
| 14 | BGWM | 25 |
| 15 | AWMC7 | 26 |
| 16 | BGPW | 27 |
| 17 | AWMC2 | 28 |
| 18 | DCFD | 29 |
| 19 | AWMC7 | 30 |
| 20 | BWMC7 | 31 |
| 21 | AWMC7 | 32 |
| 22 | BGPW | 33 |
| 23 | AWMC7 | 34 |
| 24 | BGWM | 35 |
| 25 | AWMC7 | 36 |
| 26 | BGPW | 37 |
| 27 | AWMC7 | 38 |
| 28 | DCFD | 39 |
| 29 | BWMC7 | 40 |
| 30 | AWMC7 | 41 |
| 31 | BGPW | 42 |
| 32 | AWMC7 | 43 |
| 33 | BGWM | 44 |
| 34 | AWMC7 | 45 |
| 35 | AWMC7 | 46 |
| 36 | BGPW | 47 |
| 37 | AWMC7 | 48 |
| 38 | DCFD | 49 |
| 39 | BWMC7 | 50 |
| 40 | ACfd | 51 |
| 41 | BGWM | 52 |
| 42 | AWMC7 | 53 |
| 43 | BWMC7 | 54 |
| 44 | AWMC7 | 55 |
| 45 | BGPW | 56 |
| 46 | AWMC7 | 57 |
| 47 | DCFD | 58 |
| 48 | BWMC7 | 59 |
| 49 | AWMC7 | 60 |
| 50 | ACfd | 61 |
| 51 | BGWM | 62 |
| 52 | AWMC7 | 63 |
| 53 | BGPW | 64 |
| 54 | AWMC7 | 65 |
| 55 | BCFD | 66 |
| 56 | AWMC7 | 67 |
| 57 | DGWM | 68 |
| 58 | AWMC7 | 69 |
| 59 | BGPW | 70 |
| 60 | AWMC7 | 71 |
| 61 | BGWM | 72 |
| 62 | AWMC7 | 73 |
| 63 | BGPW | 74 |
| 64 | AWMC7 | 75 |
| 65 | BGWM | 76 |
| 66 | AWMC7 | 77 |
| 67 | DGWM | 78 |
| 68 | AWMC7 | 79 |
| 69 | BGPW | 80 |
| 70 | AWMC7 | 81 |
| 71 | BWMC7 | 82 |
| 72 | BGPW | 83 |
| 73 | AWMC7 | 84 |
| 74 | DCFD | 85 |
| 75 | BGWM | 86 |
| 76 | AWMC7 | 87 |
| 77 | BGPW | 88 |
| 78 | DGWM | 89 |
| 79 | ACfd | 90 |
| 80 | AWMC7 | 91 |
| 81 | BGPW | 92 |
| 82 | AWMC7 | 93 |
| 83 | BGWM | 94 |
| 84 | AWMC7 | 95 |
| 85 | BGPW | 96 |
| 86 | AWMC7 | 97 |
| 87 | DGWM | 98 |
| 88 | BGPW | 99 |
| 89 | AWMC7 | 90 |
| 90 | BGWM | 91 |
| 91 | AWMC7 | 92 |
| 92 | BGPW | 93 |
| 93 | AWMC7 | 94 |
| 94 | BGWM | 95 |
| 95 | AWMC7 | 96 |
| 96 | BGPW | 97 |
| 97 | ACfd | 98 |
| 98 | BGWM | 99 |
| 99 | AWMC7 | 100 |
| 100 | BGPW | 101 |

图2. 在BC2F3代中，通过SPN Ax-945219402AS和SNP Ax-945380402AS两个基于SNP的PCR标记确认携带LrM的NILs的纯合性。

3.2. 对BC2F2后代行的叶锈病抗性表型检测
对25个BC2F2后代行进行了叶锈病抗性表型检测，使用了印度最具毒力和最常见的叶锈病病理型77-5，以及回交亲本HD2967、供体亲本ER9-700和 susceptible对照品Agra Local。在25个后代行中，有12行表现出纯合抗性（HR），13行表现出叶锈病抗性分离。 susceptible对照品Agra Local和回交亲本HD2967的IT（遗传型）为‘3’，而供体亲本和HR行表现为‘0’（图3）。这证实了标记在HD2967的遗传背景下选择叶锈病抗性基因‘LrM’的有效性。

3.3. HD2967+LrM NILs的细胞稳定性
对六个HD2967+LrM NILs进行了细胞学分析，发现减数第一次分裂中期存在42条染色体（21个二体）。21个二体的存在表明这些近等基因型的细胞稳定性，并且没有发生任何数值异常。这也表明背景中没有杀配子基因的影响，否则可能会导致NILs不育。图4展示了一张代表性图片，显示了21个二体的存在。

3.4. 对HD2967+LrM NILs的农艺形态特征评估
对各种农艺形态特征进行了评估，以评估NILs与其回交亲本HD2967的表型相似性。表4展示了六个近等基因型在农艺形态特征上的平均表现。除了两株（HD2967+LrM-2和HD2967+LrM-5）外，所有NILs在植株高度上没有差异，这两株比HD2967矮。在每株植物的有效分蘖数方面，三株NILs（HD2967+LrM-2、HD2967+LrM-3、HD2967+LrM-4）与HD2967没有差异，而其他三株的分蘖数较少。在每穗的小穗数方面，除了HD2967+LrM-5外，其他NILs没有差异。在每穗的籽粒数方面，除了HD2967+LrM-5外，其他NILs没有差异。在每穗的籽粒数方面，除了HD2967+LrM-3和HD2967+LrM-4外，所有NILs与HD2967没有差异。在千粒重方面，除了HD2967+LrM-3和HD2967+LrM-4外，其他NILs与HD2967没有差异。总体上，除了HD2967+LrM-5在大多数特征上表现出显著差异外，所有其他NILs的表现都与HD2967相似或更好。这表明使用适当的表型和基因分型可以在回交育种中恢复出优良的植物类型。

表4. NILs与回交亲本HD2967在不同农艺形态特征方面的比较
| 选择线 | PHS | NSL | SPL | NST | KIW | TKW |
| ---------- | -------------- | -------------- | -------------- | ------------------ | ------------ |
| HD 2967 | 10 | 1.5 | 12 | 6.5 | 38.7 |
| HD 2967+LrM NIL-1 | 10 | 1.7 | 12 | 7.6 | 5.3 |
| HD 2967+LrM NIL-2 | 10 | 1.0 | 12.0 | 5.2 | 7.6 |
| HD 2967+LrM NIL-3 | 10 | 1.0 | 13.5 | 2.1 | 5.1 |
| HD 2967+LrM NIL-4 | 10 | 10.0 | 13.5 | 2.1 | 5.7 |
| HD 2967+LrM NIL-5 | 10 | 10.0 | 13.3 | 2.1 | 5.1 |
| HD 2967+LrM NIL-6 | 10 | 10.1 | 13.5 | 2.8 | 4.0 |
| ... | ... | ... | ... | ... |

4. 讨论
开发抗病品种是管理不同作物物种病害压力最便宜、最经济且环保的方法。然而，由于病虫害的周期性爆发，大多数新引入的抗性基因在5-6年内就会失效。这导致了需要不断从野生和栽培来源中鉴定和引入新的基因。其中一个例子是来自Ae. markgrafii的叶锈病抗性基因LrM，它属于小麦的三级基因库，能提供针对多种病理型的明确抗性，其‘IT’范围从“0”到“”;”[31]。已鉴定出超过80个Lr基因，其中近50%是外来基因[36]。一些重要外来基因，如来自Ae. umbellulata的Lr9、来自Th. ponticum的Lr19和来自Ae. speltoides的Lr28，由于印度病原体的进化而失效[37]。然而减数分裂分析在这里非常重要，因为Ae. markgrafii的CC基因组在3C染色体上携带有杀配子基因[35]，这些基因会导致雄性和雌性配子部分不育[40,41]。在NILs中观察到完全的21个二联体表明杀配子基因没有产生任何残留效应，它们的后代也将完全不受任何类型的不育影响。对NILs进行农艺形态学评估对于恢复高产的亲本植物类型至关重要。通常，引入抗病基因可能会导致初始品系的农艺表现显著下降。然而，在我们当前的研究中，从Ae. markgrafii衍生物ER9-700中引入的抗叶锈病基因LrM并没有导致大多数NILs的农艺形态学特征发生显著变化，NIL-5除外。NIL-5的植株高度比RP HD2967更矮，而RP HD2967本身是一种可以减少倒伏的优良植物类型。NIL-5的穗长和每穗小穗数较少，而NIL-6的穗长也较低，但每穗种子数没有差异，这可能是由于这些NILs的小穗密度较高和花序结实性更好。NIL-3和NIL-4的每穗种子数以及千粒重显著增加，而NIL-2的株高较低但千粒重较高，是六个NILs中最有潜力的。因此，可以说，表型选择和标记辅助的背景选择在仅两次回交和一代自交中就帮助我们识别出了优良的NILs。早前，同样的技术也被用于在小麦品种HD2932[12]、HD2967[16,17]和HD3086[39]的背景下培育出优良的NILs。因此，在本研究中，我们成功地将来自Ae. markgrafii衍生物ER9-700的抗叶锈病基因LrM转移到了大型小麦品种HD2967中，所培育出的NILs在细胞学上是稳定的，并且性能与RP HD2967相当或更优。这些NILs可以在经过多点试验后直接作为新品种发布，或者作为其他育种计划中该抗叶锈病基因的适宜供体。LrM基因还可以与其他抗叶锈病基因（如LrTrk[16]和Lr34[17]）结合使用，这些基因也存在于HD2967的背景下，以防止LrM因遇到致病菌株而失效，并提高HD2967的抗性。

**5. 结论**
本研究成功地展示了通过标记辅助回交育种将从Ae. markgrafii衍生物ER9-700转移的抗叶锈病基因LrM到流行的面包小麦品种HD2967。标记辅助的前景和背景选择以及表型选择帮助我们在仅两次回交和一代自交中培育出了与RP HD2967性能相当或更优的NILs。这些NILs表现出高度的抗性，IT值为‘0’，在细胞学上稳定，且没有受到Ae. markgrafii CC基因组中杀配子基因的残留影响。从这项研究中得到的NILs可以作为HD2967的改进版本，与其他主要或次要的抗叶锈病基因结合使用以提高抗性，或者作为其他育种计划中抗叶锈病的潜在来源。

**作者贡献声明**
Amitava Roy：撰写——原始草稿、调查、正式分析、数据管理。
Manish K. Choudhary：调查、数据管理。
Abhijeet Mudhale：撰写——审阅与编辑、正式分析。
Shivani：正式分析、数据管理。
M. Niranjana：撰写——审阅与编辑、监督、资源获取、资金筹集。
Shailendra K. Jha：撰写——审阅与编辑、监督、资源获取、资金筹集、概念化。
M.S. Saharan：撰写——审阅与编辑、资金筹集。
Vinod：监督、资源获取、概念化。
Niharika Mallick：撰写——审阅与编辑、监督、资源、方法学、资金筹集、概念化。

**资助**
本研究由印度政府生物技术部门在项目“小麦（Triticum aestivum L.）多重生物胁迫新抗性基因的绘图与转移”（项目编号BT/PR33041/AGIII/1166/2019）的支持下进行。

**作者名单**
Amitava Roy | Manish K. Choudhary | Abhijeet Mudhale | Shivani | M. Niranjana | Shailendra K. Jha | M.S. Saharan | Vinod | Niharika Mallick
遗传学系，ICAR-印度农业研究所，新德里，110012，印度