发酵豇豆纳豆中分离的葡聚糖的结构表征及其体外α-淀粉酶抑制与胆汁酸结合特性

《Food Science & Nutrition》：Structural Characterization and In Vitro α-Amylase Inhibitory and Bile Acid-Binding Properties of a Glucan Isolated From Fermented Cowpea Natto

　　

豇豆纳豆是一种具有潜在功能特性的发酵豆类食品。然而，发酵对豇豆多糖的影响尚不完全清楚。本研究使用枯草芽孢杆菌纳豆（Bacillus subtilis natto）发酵豇豆，并对从未发酵豇豆（JD）和发酵豇豆纳豆（JD-F）中提取的多糖进行了比较表征。发酵使多糖得率提高了35.60%。从JD-F中分离纯化得到一个均一多糖，命名为JDFE1-F，其重均分子量（M_w）为5.175 kDa。单糖组成分析表明，JDFE1-F主要由葡萄糖（Glc，98.22%）组成。甲基化分析和核磁共振（NMR）波谱法揭示，JDFE1-F的主链主要由→4)-α-D-Glcp-(1→残基组成，且在O-6位有少量取代。其分支区域含有末端α-D-Glcp-(1→残基和少量α-D-Glcp-(1→5)-α-L-Araf-(1→结构基序。纯化后，JDFE1-F的总碳水化合物含量提高到85.12%±3.09%。JDFE1-F对α-淀粉酶的IC₅₀为2.668±0.281 mg/mL，显著低于JD（p<0.05）。在4 mg/mL浓度下，JDFE1-F结合了58.09%±2.58%的甘氨脱氧胆酸钠和60.79%±2.87%的牛磺脱氧胆酸钠。JDFE1-F达到50%甘氨脱氧胆酸钠结合率所需的浓度显著低于JD（p<0.05），而三种制备物对牛磺脱氧胆酸钠的结合能力无显著差异。这些结果表明，枯草芽孢杆菌纳豆发酵提高了多糖得率，并与豇豆多糖的组成和体外功能特性变化相关。JDFE1-F的低分子量、富含葡萄糖的组成和分支α-葡聚糖结构可能与其观察到的体外活性有关，为其结构-功能关系和生理相关性的进一步研究提供了基础。

**发酵豇豆纳豆来源葡聚糖的结构表征与体外功能特性研究解读**

发酵是改善植物源食品安全性、营养品质和货架期的成熟生物技术。纳豆传统上由枯草芽孢杆菌纳豆（*Bacillus subtilis* natto）发酵大豆制成，含有纳豆激酶和多糖等生物活性成分。豇豆（*Vigna unguiculata* L.）是重要豆类，营养价值高、环境适应性强，适合作为纳豆型发酵底物。豆类多糖因具有降血糖、降血脂等潜在活性而受到关注，但常规提取产率低，且常含高分子量或难溶性组分，限制了其功能性和应用。微生物发酵可温和地改变多糖结构，提高提取率。已有研究表明，芽孢杆菌发酵可提高多糖提取率、改变分子量和活性，但枯草芽孢杆菌纳豆发酵豇豆后均一多糖的结构及其与α-淀粉酶（α-amylase）抑制和胆汁酸（bile acid）结合的关系尚未系统研究。研究人员假设发酵能改变豇豆多糖组成并富集具有特定结构和功能的多糖组分，因此开展了本研究。

研究人员将豇豆经枯草芽孢杆菌纳豆发酵制成豇豆纳豆，从未发酵豇豆（JD）和发酵豇豆纳豆（JD-F）中提取多糖，比较了提取率；从JD-F中经离子交换和尺寸排阻色谱纯化得到均一多糖JDFE1-F，综合运用色谱、质谱和核磁共振技术表征了其分子量、单糖组成、糖苷键连接方式和分支结构；同时测定了JD、JD-F和JDFE1-F的化学组成、α-淀粉酶抑制活性和胆汁酸结合能力。结果表明，发酵使多糖提取率提高了35.60%；JDFE1-F为重均分子量5.175 kDa的葡萄糖富集型α-葡聚糖，主链为→4)-α-^D-Glcp-(1→，在O-6位有少量分支；纯化后总碳水化合物含量达85.12%。JDFE1-F的α-淀粉酶IC₅₀为2.668 mg/mL，显著低于JD；其结合甘氨脱氧胆酸钠的能力也显著强于JD。该研究为发酵来源豆类多糖的结构-功能关系研究及功能食品应用提供了基础。

主要关键技术方法：豇豆种子（品种NO. 2）由湖北省豆类植物工程技术研究中心提供，枯草芽孢杆菌纳豆菌株CICC 10263购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。研究人员采用热水提取和乙醇沉淀制备粗多糖JD和JD-F；以DEAE-Sepharose阴离子交换色谱和Sephacryl S-300尺寸排阻色谱纯化得到JDFE1-F。结构表征采用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、高效凝胶渗透色谱（HPGPC）、高效液相色谱（HPLC）单糖组成分析、甲基化结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）以及一维/二维核磁共振（NMR）。化学组成用苯酚-硫酸法、间羟基联苯法和Bradford法测定。活性评价包括α-淀粉酶抑制试验和离体胆汁酸结合试验。

研究结果如下：

3.1 提取、分离和纯化：JD和JD-F的提取产率分别为4.55%和6.17%，发酵使产率提高35.60%，可能与发酵破坏植物细胞壁、促进多糖释放有关。JD-F经离子交换色谱得到四个含糖组分，其中JDF-E1和JDF-E2为主；JDF-E1再经尺寸排阻色谱纯化得到JDFE1-F，HPGPC显示单一对称峰，表明均一性好。

3.2 FT-IR分析：JDFE1-F在3405 cm^-1（O-H伸缩）、2930 cm^-1（C-H）、1640 cm^-1（结合水）、1154/1081/1020 cm^-1（C-O-C和C-O）处有吸收，855 cm^-1提示α-糖苷键，表明为含吡喃糖环的α-葡聚糖。

3.3 分子量和单糖组成：HPGPC测得JDFE1-F的M_w为5.175 kDa，多分散系数（M_w/M_n）为1.36，分布较窄。HPLC分析显示其单糖以葡萄糖（Glc）为主（98.22%），还含微量甘露糖（Man）、半乳糖（Gal）和阿拉伯糖（Ara）。

3.4 甲基化分析：甲基化/GC-MS检出1,5-Araf、t-Glcp、1,4-Glcp和1,4,6-Glcp，摩尔比分别为1.40%、12.00%、81.02%和5.58%。表明主链以1,4-Glcp为主，1,4,6-Glcp为O-6分支点，t-Glcp为末端残基。

3.5 NMR波谱分析：一维和二维NMR归属了各糖基残基，包括→4)-α-D-Glcp-(1→（残基A）、→4,6)-α-D-Glcp-(1→（残基B）、末端α-D-Glcp-(1→（残基T）、→5)-α-L-Araf-(1→（残基D）及还原端残基Rα、Rβ。HMBC和NOESY相关证明主链由A和B通过(1→4)键连接，B的O-6位可被T或D取代，且T还可连接至D的O-5位，从而形成α-D-Glcp-(1→5)-α-L-Araf-(1→侧链结构。

3.6 化学组成：JD的总碳水化合物、蛋白质、糖醛酸含量分别为33.58%、8.47%、1.01%；JD-F分别为44.03%、未检出、8.22%；JDFE1-F分别为85.12%、未检出、9.16%。发酵和纯化显著提高了总碳水化合物含量，并几乎完全去除蛋白质。

3.7 α-淀粉酶抑制活性：JD、JD-F和JDFE1-F均呈浓度依赖性抑制α-淀粉酶。IC₅₀分别为7.286、3.509和2.668 mg/mL，JD-F和JDFE1-F显著低于JD（p<0.05），JDFE1-F活性最强。纯化提高了有效多糖浓度，低分子量和葡萄糖丰富结构可能有利于与酶相互作用。

3.8 胆汁酸结合能力：在4 mg/mL时，JDFE1-F结合了58.09%甘氨脱氧胆酸钠和60.79%牛磺脱氧胆酸钠。达到50%甘氨脱氧胆酸钠结合所需的浓度，JDFE1-F（1.711 mg/mL）显著低于JD（3.431 mg/mL），但与JD-F无显著差异；而牛磺脱氧胆酸钠结合所需浓度在三者间无显著差异。表明发酵纯化对胆汁酸结合的改善具有特异性。

讨论部分指出，发酵可改变多糖的提取率、分子量、单糖比例和链构象，从而影响活性。JDFE1-F的低分子量可能有利于分散和接触靶标，富含葡萄糖和α-(1→4)键的结构可能通过氢键等与α-淀粉酶活性位点结合，但其低分子量和低糖醛酸含量排除了粘性屏障和羧基介导为主要机制。胆汁酸结合可能涉及氢键和表面吸附，且不同胆汁酸的结合差异可能与胆酸结构有关。

结论：研究人员从发酵豇豆多糖中分离纯化得到均一多糖JDFE1-F，其M_w为5.175 kDa，是以→4)-α-D-Glcp-(1→为主链、O-6位有少量分支的葡萄糖富集型α-葡聚糖，分支含末端α-D-Glcp和少量α-D-Glcp-(1→5)-α-L-Araf侧链。纯化后总碳水化合物含量显著提高。JDFE1-F表现出明显的体外α-淀粉酶抑制和胆汁酸结合活性，其α-淀粉酶IC₅₀显著低于JD，甘氨脱氧胆酸钠结合能力显著强于JD，而牛磺脱氧胆酸钠结合与JD和JD-F无显著差异。该研究将多糖精细结构与体外功能联系起来，为豆类多糖的功能食品应用提供了依据。但研究也存在局限性，如未进行脱淀粉处理、发酵过程中的结构变化未完全解析、活性仅在体外评价，未来需通过比较结构分析、机制研究、模拟消化和体内验证进一步明确其结构来源、构效关系和生理相关性。