双位点DNA宏条形码揭示南非稀树草原旱季非洲象与黑斑羚的食性分化

《Ecology and Evolution》：Dual-Locus Metabarcoding Reveals Dry-Season Dietary Differentiation Between Elephants and Impalas in a South African Savanna

　　

非洲稀树草原中的大型食草动物在旱季面临严峻的营养限制，此时饲草质量下降加剧了对有限资源的竞争。因此，同域分布的混合食性动物在饲草资源的利用上预期存在差异，然而支撑这些食性差异的具体植物类群仍未得到很好的解析。本研究采用双位点DNA宏条形码（rbcL和trnL）对南非一个半干旱稀树草原生态系统中非洲象（Loxodonta africana）和黑斑羚（Aepyceros melampus）的旱季食性进行了表征与比较。尽管两者在体重和消化生理上存在显著差异，但两种食草动物在两个分子标记下的食性α多样性均无显著差异。相反，基于出现频率（FOO）的Jaccardβ多样性分析显示，两个物种间的食性组成在两个标记下均存在显著差异，其中trnL标记检测到的分化最强。Pianka生态位重叠指数和相对读长丰度分析支持上述模式，显示种间重叠低于种内重叠。两种食草动物在旱季均高度依赖木本植物类群。象的食性组成较为狭窄，以Grewia、Dichrostachys和Vachellia等 browse 属为主，而黑斑羚则摄入了由木本、禾草和杂类草类群组成的更多样化的混合物。研究结果表明，这两种混合食性动物在旱季的食性分化主要不体现在总体食性宽度上，而是体现在精细的类群差异以及对木本、禾草和杂类草资源的不同利用上。这些结果凸显了维持饲草资源中类群和生长型异质性对于在日益多变的环境条件下支持稀树草原食草动物群落的重要性。

**论文解读：双位点DNA宏条形码揭示南非稀树草原旱季非洲象与黑斑羚的食性分化**

**1. 研究背景与科学问题**

非洲稀树草原具有强烈的季节性降水反差，导致饲草可利用性和质量发生剧烈波动。旱季期间，C4禾草衰老，纤维和木质素浓度急剧升高，消化率降低，大型哺乳动物食草动物面临严重的营养瓶颈。为应对 grazing 资源的季节性短缺和营养质量下降，食草动物通常采取两种非排他性策略：空间迁移或调整食性组成以利用替代植物资源，包括C3木本植物和多年生杂类草。这些植物在旱季常能保留叶片和相对较高的营养质量，成为重要的旱季饲草。然而，围栏、土地利用变化和栖息地破碎化限制了食草动物的迁移，使其更加依赖局部可利用的饲草，因此饲草异质性对于维持混合食性策略至关重要。

非洲象（Loxodonta africana）和黑斑羚（Aepyceros melampus）是研究混合食性策略的理想对象。两者在大克鲁格系统内数量丰富且同域分布，但处于体重和消化生理的两个极端：象是大型后肠发酵者，能通过高摄食量和快速肠道通过处理大量粗纤维；黑斑羚是小型反刍动物，具有较长肠道滞留时间和相对较高的营养需求，难以依赖富含纤维和单宁的 browse。尽管两者在湿季均主要以禾草为食，旱季因禾草质量下降而转向 browse，但消化生理、体重和移动尺度的差异可能驱动其形成不同的旱季食性。传统微组织学分析和稳定同位素技术虽能刻画总体食性模式，但缺乏检测选择性摄食、低丰度或隐存植物类群所需的分类分辨率。单标记宏条形码虽有改进，但仍易受标记特异性偏差影响，而双位点宏条形码能提高类群恢复率并减少偏差。因此，本研究利用双位点DNA宏条形码，在南非Timbavati私人自然保护区（大克鲁格国家公园的一部分）内，定量解析非洲象和黑斑羚的旱季食性，重点识别导致两者食性分化的植物类群和功能群（生长型），并检验以下假设：（i）旱季象和黑斑羚的食性多样性和组成存在差异；（ii）这些差异同时体现在植物类群的出现频率和相对贡献上。

**2. 主要关键技术方法**

研究人员在南非Limpopo省Lowveld生物区Timbavati私人自然保护区（约53,400 ha，属大克鲁格国家公园保护地）开展野外工作。于2018年10月（旱季末期）采集24头象和24头黑斑羚的新鲜粪便样本，每份约10 g，冷藏保存。使用Qiagen DNeasy Plant Mini Kit提取粪便DNA，扩增叶绿体rbcL和trnL（UAA内含子）区域，采用Illumina Nextera XT Index Kit建库，在Illumina MiSeq平台（2×300 bp）双端测序。生物信息学流程包括Cutadapt去除引物、DADA2降噪推断ASV、LULU后聚类校正、丰度和频率过滤；利用研究区域特异性参考数据库（rbcL库含562种，trnL库含461种，并新增58个GenBank序列）进行BLASTn分类分配。统计分析包括Shannon指数（α多样性）、Jaccard距离NMDS排序、PERMANOVA/ANOSIM/PERMDISP（β多样性）、Pianka生态位重叠指数、FOO和RRA分析、Sankey图可视化及DESeq2差异丰度分析。

**3. 研究结果**

**3.1 宏条形码序列总结与参考数据库评估**

Illumina MiSeq测序共获得10,137,912条rbcL和10,723,495条trnL读长。经DADA2降噪、LULU校正和严格丰度过滤后，保留244个rbcL ASV和697个trnL ASV。一个黑斑羚个体（样本48）因两个标记的读长深度不足被排除。另移除260个非植物ASV（主要为细菌和病毒序列）及4个对照/污染ASV。分类分配成功率因标记而异：rbcL数据集中未分配（NA）读长比例较高（象33.8%，黑斑羚19.9%），trnL数据集较低（象8.5%，黑斑羚3.0%）。3个象样本在rbcL和3个在trnL中仅产生未分配读长，而所有黑斑羚样本均获得成功分类。

**3.2 食性多样性与种间重叠**

基于Shannon指数的α多样性显示，象与黑斑羚在两个标记下均无显著差异（rbcL: p=0.934；trnL: p=0.672），表明两者维持了相当的食性宽度。基于FOO的Jaccard距离β多样性分析显示，两种食草动物间食性组成差异显著。rbcL标记中PERMANOVA（pseudo-F_1,42=5.62, p=0.001）和ANOSIM（R=0.32, p=0.001）显示中度但显著的分隔，但PERMDISP显著（F_1,42=15.06, p=0.001），提示部分模式可能源于组内离散度不均。trnL标记则显示更强的分离（PERMANOVA pseudo-F_1,42=10.61, p=0.001；ANOSIM R=0.81, p=0.001），且PERMDISP不显著（F_1,42=1.37, p=0.202），表明分离主要来自组成差异。Pianka重叠指数显示，trnL标记下种内重叠（0.68）远高于种间重叠（0.009），Mann–Whitney U检验证实两标记下种间重叠均显著低于种内重叠（p<0.001）。

**3.3 食性组成与种间分化**

FOO Sankey图显示，象的食性以木本 browse 为主：rbcL标记中Grewia（47.6%）、Vachellia（42.9%）和Dichrostachys（38.1%）占优势，且这些属在黑斑羚食性中缺失；trnL标记中Grewia（100%）、Combretum（90.5%）、Senegalia（81.0%）、Dichrostachys（76.2%）和Euclea（76.2%）高度普遍。黑斑羚食性则包含更多禾草和杂类草：trnL中Urochloa出现率高达87.0%（象仅9.5%），Bothriochloa为30.4%，并包括杂类草Tylosema（39.1%）和Ruellia（26.1%）。标记间存在明显差异，例如Megathyrsus在rbcL中于黑斑羚食性100%检出，但在trnL中仅17.4%，说明双标记互补性的价值。

**3.4 食性属的差异丰度**

DESeq2分析确认了属水平的显著分化（校正p<0.05，|log2 fold change|>1）。象的食性强烈富集于狭窄的木本 browse 类群，如Grewia（效应量最大）、Dichrostachys、Senna和Vachellia（rbcL），以及Grewia、Dichrostachys、Diospyros和Indigofera（trnL）。黑斑羚食性则在多个功能群中富集，包括木本属（Carissa、Rhoicissus、Euclea、Schotia、Mystroxylon、Spirostachys、Pyrostria、Cryptolepis、Combretum）和禾草属Urochloa，以及杂类草属（Asparagus、Melhania）。这定量证实了食性分化沿功能群差异构建。

**4. 讨论**

研究结果表明，尽管象和黑斑羚同为混合食性动物，但在旱季呈现明显的食性分化。关键发现是α多样性无显著差异，而β多样性显示强组成分歧和低生态位重叠，说明同域混合食性动物的共存更多地依赖于特定植物类群的差异利用，而非总体食性宽度的不同。这一模式不完全符合Jarman–Bell原理对体型的经典预测，但支持了消化生理对比鲜明的食草动物可能维持相似食性多样性同时通过功能群分化来分割资源的观点。象作为大型后肠发酵者，可耐受富含单宁和油脂的木本 browse（如Vachellia和Dichrostachys），而黑斑羚作为小型反刍动物，更依赖营养密度较高的禾草和杂类草，以平衡营养获取与消化约束。杂类草属（如Asparagus、Melhania、Tylosema和Ruellia）在黑斑羚食性中的较高频率，提示其在旱季可能补充营养。此外，两者移动尺度的差异（象大范围移动，黑斑羚家域较小）也可能导致其遇到不同的植物组合。双位点宏条形码框架有效减少了引物偏差，互补地解析了Megathyrsus和Urochloa等单标记可能遗漏的类群。但研究存在局限性：仅代表单个旱季末期快照，无法评估季节间变化；缺乏同步的植物可利用性调查，无法区分主动选择与遭遇差异；宏条形码数据不能直接估计摄食量或生物量。未来应整合植被可利用性调查、营养分析、季节性采样和行为观察。从管理角度看，所鉴定的旱季候选饲草类群，尤其是杂类草，应纳入植被监测，以维持饲草异质性和食草动物群落的饮食灵活性。

**5. 结论**

本研究证明，在共享的稀树草原景观中，非洲象和黑斑羚在旱季表现出明显的食性分化。尽管两者食性多样性水平相当，但食性组成差异显著：象主要依赖木本 browse 类群，而黑斑羚摄入包含木本、禾草和尤其杂类草资源的更广泛混合物。这种精细的类群分化可能在饲草限制期减少同域混合食性动物间的食性重叠。研究进一步证明了双位点DNA宏条形码在解析复杂食草动物食性和识别单标记方法可能遗漏的分类学模式方面的价值。木本 browse 是食性分歧的主要基础，但多种禾草和杂类草类群也促进了分化，尤其在黑斑羚食性中。这些发现表明，类群和功能上的饲草异质性可能有助于稀树草原食草动物的食性灵活性和资源分配。在气候变率和人为压力增加的背景下，特定旱季饲草类群的减少或丧失可能降低食性分化机会并增加同域食草动物间的资源重叠。因此，稀树草原监测和管理应考虑木本和草本植被的多样性及组成，包括在以树木和禾草为中心的评估中可能被忽视的杂类草类群。