核苷酸共递送调控LNP递送mRNA的细胞内命运以增强翻译

《Nano Today》：Nucleotide co-delivery modulates intracellular fate of LNP-delivered mRNA to enhance translation

摘要

信使核糖核酸（mRNA）疗法为蛋白质生产提供了一个多功能平台，但在递送过程中保持mRNA的完整性仍然是一项重大挑战。在此，我们报告了核苷酸与脂质纳米颗粒（LNP）制剂mRNA共同递送可显著增强多种细胞类型的翻译效率。系统筛选鉴定出三磷酸腺苷（ATP）和三磷酸鸟苷（GTP）为有效增强剂，使蛋白质表达量提高高达13倍，同时伴随细胞内完整mRNA水平增加约6–8倍。非水解性核苷酸类似物腺苷酰亚胺二磷酸（AMP-PNP）和鸟苷酰亚胺二磷酸（GMP-PNP）保留了可比的表达增强活性，表明该效应不需要磷酸键水解或经典的ATP/GTP依赖性能量供应。机制分析显示，在测试条件下细胞摄取和内体逃逸基本未变。核苷酸延缓了LNP递送mRNA在培养基中的降解，保护了纯化mRNA免受RNase A介导的降解，并减少了纯化酶和细胞裂解液实验中的RNA底物切割。核苷酸共同包封还改善了小鼠肌肉注射后的报告基因表达。综上，这些发现支持mRNA保存是表达增强的贡献因素，并提示在早期递送过程中可能存在瞬态保护环境。本研究为核苷酸辅助mRNA递送提供了机制洞察，并为mRNA疫苗和蛋白质替代疗法的进一步开发奠定了基础。

引言

信使核糖核酸（mRNA）疗法已成为蛋白质替代[1]、[2]、疫苗接种[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]和基因调控[10]、[11]、[12]的多功能平台。随着脂质纳米颗粒（LNP）递送系统的开发，mRNA的高效胞内递送已成为可能；然而，整体蛋白质产出仍然受到递送后胞内过程的限制，特别是胞质释放后具有翻译能力的mRNA快速丢失[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]。因此，改善递送mRNA有效利用的策略对于增强治疗效果越来越重要。

目前改善mRNA功能的努力主要集中于优化mRNA序列设计，包括核苷修饰和非翻译区工程，这些主要在转录本设计层面发挥作用[25]、[26]。相比之下，较少的方法探索了共同递送的小分子是否能通过调节胞内环境来影响递送后mRNA的行为。

内源性代谢物共同递送已成为改善mRNA-LNP性能的一种策略。近期研究表明，ATP共同包封可在体外和体内增强多种LNP制剂中mRNA编码的蛋白质表达[27]。后续工作将该策略扩展至其他代谢物，包括GTP，支持其适用于ATP以外的范围[28]。然而，核苷酸结构特征如何影响mRNA对降解的抗性，以及这种保护与蛋白质表达之间的关系，仍未得到充分理解。在此，我们结合系统的核苷酸类似物筛选与mRNA稳定性和RNA切割实验来调查这些关系（图1a）。通过考察核酸碱基身份、磷酸基团数目、核糖修饰和水解敏感性，我们评估了核苷酸相关的RNA保存对增强mRNA递送的贡献。

章节摘要

核苷酸筛选鉴定出ATP和GTP为LNP介导mRNA翻译的强效增强剂

我们筛选了一系列核苷酸，与mKate2报告基因mRNA通过LNP在PANC1细胞（人胰腺癌）中共同递送[29]（图S1）。LNP制剂基于临床验证的mRNA疫苗和此前报道核苷酸辅助增强mRNA表达研究所使用的脂质组成[27]、[30]、[31]。在0.25 mg/mL浓度下，三磷酸腺苷（L-ATP）和5'-三磷酸鸟苷（L-GTP）共同递送产生最显著的翻译增加

讨论

此前代谢物辅助mRNA递送研究确立了ATP共同包封作为增强mRNA-LNP介导蛋白质表达的有效策略，随后将该概念扩展至更广泛的代谢物空间[27]、[28]。我们的发现在这些研究基础上提供了额外的机制解析。首先，抗水解的AMP-PNP和GMP-PNP保留了表达增强活性，表明末端磷酸水解和经典能量补充是

结论

总之，核苷酸共同包封增强了所考察细胞类型中LNP介导的mRNA表达，并改善了体内报告基因表达。ATP和GTP延缓了LNP递送mRNA在培养基中的降解，保护了纯化mRNA免受RNase A介导的降解，并减少了纯化酶和细胞裂解液实验中的RNA底物切割。结合增加的胞内mRNA丰度以及在测试条件下基本未变的细胞摄取和内体逃逸

mRNA体外转录

pT7[mKate2]质粒（VectorBuilder）（ESM中表S1）使用BspQI限制性内切酶（R0712S，New England Biolabs）线性化，并使用通用DNA纯化和回收试剂盒（DP214，TIANGEN）纯化。线性化模板使用HiScribe? T7 ARCA mRNA试剂盒（带加尾）（E2060S，New England Biolabs）转录为加帽和加聚腺苷酸尾的mRNA。所得mRNA使用Monarch? Spin RNA Cleanup Kit（T2050S，New England Biolabs）纯化。

RNA底物

伦理声明

本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经武汉赛为尔生物科技有限公司实验动物管理与使用委员会批准。（批准号：2026080）

CRediT作者贡献声明

李玄宇：撰写—初稿、可视化、验证、项目管理、方法学、调查、资金获取、形式分析、数据整理、概念化。秦智良：项目管理、形式分析、数据整理。陈瑶：项目管理、调查。吴家才：项目管理。张灵敏：撰写—审阅与编辑、监督、资金获取。蒋星宇：撰写—审阅与编辑、验证、监督、资源，

利益冲突声明

作者声明不存在已知的可能影响本文所述工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

我们感谢中国国家重点研发计划（2023YFA0915700）、深圳市医学研究基金（A2504001）、中国国家自然科学基金（22234004, 22427804, 82572415）、广东省先进生物材料重点实验室（2026B1212170002）、深圳市科技计划项目（KJZD20240903101359020）、深圳市智慧医疗工程重点实验室（ZDSYS20200811144003009）、医学研究创新项目（G030410001）、高层次人才专项基金（

李玄宇|秦智良|陈瑶|吴家才|张灵敏|蒋星宇

国家药品监督管理局和呼吸疾病国家重点实验室，呼吸医学广东省基础研究中心卓越中心，广州医科大学药学院，广州，511436，中华人民共和国