《Nature Aging》：Brain DNA methylation, APOE genotype and Alzheimer’s disease neuropathology in a large postmortem cohort
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DNA甲基化（DNA methylation, DNAm）在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）中发挥关键作用。既往基于450K芯片的表观基因组关联研究（epigenome-wide association study, EWAS）仅
DNA甲基化（DNA methylation, DNAm）在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）中发挥关键作用。既往基于450K芯片的表观基因组关联研究（epigenome-wide association study, EWAS）仅覆盖有限的CpG位点，且常聚焦于单一神经病理学指标。在本研究中，研究人员利用Infinium MethylationEPIC v2芯片（约930,000个CpG位点）对来自Rush阿尔茨海默病队列（Rush Alzheimer’s Disease cohorts）的1,250例死后前额叶皮层样本进行了DNAm图谱分析，并针对多项神经病理学指标开展了表观基因组关联研究，包括AD诊断、淀粉样蛋白-β（amyloid-β, Aβ）和tau蛋白缠结（tau tangles）。研究人员鉴定了107个与AD神经病理学相关的差异甲基化探针（differentially methylated probe, DMP），其中38个在独立队列（n = 139）中得到复制。DNAm还部分中介了APOE基因型对AD诊断的影响（中介比例：8.6%，P = 2 × 10?6）。此外，鉴定的39个基因（例如RIN3、LGMN、LHPP）在包括神经元和星形胶质细胞在内的主要脑细胞类型中差异表达。这些发现扩展了AD神经病理学的表观遗传学图景，并揭示DNAm是APOE相关遗传风险的中介因子。
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）以进行性认知衰退为临床特征，其病理表现为脑内淀粉样斑块沉积、神经原纤维缠结及神经元丢失。DNA甲基化（DNA methylation, DNAm），尤其是5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine, 5mC），是哺乳动物基因组中含量最丰富且被广泛研究的表观遗传修饰，参与调控神经发生、学习记忆及突触可塑性。既往利用450K芯片开展的表观基因组关联研究（epigenome-wide association study, EWAS）受限于CpG位点覆盖度较低，且多采用单一神经病理指标（如Braak分期），难以全面刻画AD的表观遗传改变。同时，APOE ε4等位基因作为晚发AD最强的遗传风险因素，其相关风险可能部分经由表观遗传调控介导。针对上述问题，研究人员利用覆盖约93万个CpG位点的Infinium MethylationEPIC v2芯片，在1,250例来自Rush阿尔茨海默病中心（Rush Alzheimer’s Disease Center, RADC）队列的死后背外侧前额叶皮层（dorsolateral prefrontal cortex, DLPFC）样本中开展大规模EWAS，同时评估病理学AD诊断、淀粉样蛋白-β（amyloid-β, Aβ）负荷和PHFtau蛋白缠结三项神经病理指标，并进一步整合单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）数据，探究DNAm在APOE基因型与AD病理关联中的中介作用。研究发现107个与AD神经病理相关的差异甲基化探针（differentially methylated probe, DMP），其中38个在荷兰脑库（Netherlands Brain Bank, NBB）独立队列（n = 139）中得到验证；DNAm评分可有效区分AD与非AD个体；DNAm部分中介APOE基因型对AD诊断的影响。相关成果发表于《Nature Aging》。
技术上，发现队列来自RADC的1,250例DLPFC样本，采用Infinium MethylationEPIC v2芯片；复制队列包括NBB（139例DLPFC，EPIC v1）、Banner Sun Health Research Institute（BSHR）队列（117例额下回、127例颞上回）及ROSMAP独立子集（50例DLPFC、50例纹状体），均使用EPIC v1芯片。分析流程包括：以线性回归模型调整年龄、性别、种族、死后间隔（postmortem interval, PMI）、NeuN阳性细胞比例、实验批次及替代变量进行EWAS；使用comb-p软件进行差异甲基化区域（differentially methylated region, DMR）分析；采用R包mediation进行中介分析；基于437例同个体DLPFC的snRNA-seq数据进行细胞类型特异表达分析；开展甲基化数量性状位点（methylation quantitative trait locus, mQTL）定位与coloc共定位分析以及GARFIELD功能富集分析。
研究结果如下。DNAm alterations are associated with AD neuropathology——在RADC发现队列中，研究人员通过EWAS鉴定出107个与AD神经病理显著相关的DMPs（Benjamini–Hochberg校正的假发现率（false discovery rate, FDR）< 0.05），其中9个与病理学AD诊断相关、65个与Aβ负荷相关、46个与PHFtau缠结相关；12个DMPs与两项以上病理指标相关，1个探针（cg08550059）与全部三项指标相关。38个DMPs在NBB独立队列中方向一致且达到显著（FDR < 0.05）。基于该38个DMPs构建的DNAm评分在BSHR和ROSMAP两个独立队列中均显著高于AD患者，验证了发现的稳健性。DMR分析进一步鉴定出与Aβ相关的13个、与PHFtau相关的20个DMRs。DNAm mediates the association between APOE genotype and neuropathologic diagnosis of AD——38个复制DMPs中有23个与APOE ε4携带状态显著相关；单个DMP对APOE-AD关联的中介比例为1.8%至5.9%；由23个APOE相关DMPs构成的DNAm评分显著中介了8.6%的APOE-AD关联（95%置信区间4.3%–14.6%，P = 2 × 10
?6）。Cell-type-specific expression of genes associated with AD neuropathology——67个DMP注释基因中39个（如RIN3、LGMN、LPP）在snRNA-seq鉴定的七类主要脑细胞类型中差异表达，其中13个与全部三项神经病理指标显著相关（FDR < 0.05）；多数基因在AD患者兴奋性与抑制性神经元中表达下调，而在小胶质细胞、少突胶质前体细胞及少突胶质细胞中表达上调。Genetic coregulation and enrichment analysis——coloc共定位分析显示RIN3的DNAm与基因表达在小胶质细胞中共享遗传调控（PP4 > 0.8）；GARFIELD富集分析表明DMPs显著富集于可及染色质、转录起始位点、增强子状态及H3K4me3、H3K27ac、H3K9ac等激活相关组蛋白修饰区域。以遗传主成分替代种族协变量的敏感性分析结果高度一致，验证了人群分层控制的充分性。
讨论部分指出，38个复制DMPs中，16个（如ANK1、CAMTA1、RHOB、LPP）与既往PFC区域AD EWAS结果重叠，4个位于AD全基因组关联研究（genome-wide association study, GWAS）易感位点（RIN3、WDR81、TMEM121、FOXF1），7个被Agora数据库列为潜在AD药物靶点。多个DMPs在三个神经病理表型间效应方向完全一致，表明共享的表观遗传机制；同时部分CpG位点仅与单一表型显著关联（20个仅与tau病理相关、14个仅与Aβ负荷相关），提示不同病理通路的特异性。中介相关DMPs均不位于19号染色体（APOE所在染色体），提示APOE可能通过脂质代谢、免疫-小胶质细胞激活等途径重塑远端位点DNAm。研究局限包括bulk组织掩盖细胞类型特异信号、受试者以欧洲血统高学历老年人为主、复制队列样本量较小、缺乏其他队列APOE基因型数据、富集分析资源部分来自脑外组织，以及横断面设计无法确立因果关系。
研究结论：在大型老年死后队列中，研究人员鉴定出与多项AD神经病理学指标相关的差异甲基化基因；其中许多基因在主要脑细胞类型中亦差异表达，且结果在独立队列中得到成功复制。重要地，DNAm可能部分中介APOE基因型与AD病理之间的关联，为理解AD发病的表观遗传机制及识别潜在治疗靶点提供了新线索。
