基于代谢组学的青豆摄入生物标志物研究

《Molecular Nutrition & Food Research》：Metabolomics Based Biomarkers of Green Beans Intake

尽管豆类作为食物来源受到广泛关注，但目前尚无经过验证的青豆（Phaseolus vulgaris，L.）摄入生物标志物。本研究旨在识别并评估青豆食物摄入生物标志物的剂量-反应关系。在一项急性干预研究中，27名参与者在研究中心食用青豆，并在食用前后收集尿液样本。代谢物通过核磁共振氢谱（1H-NMR）和液相色谱-质谱联用（LC–MS）进行测定。统计分析确定了食用青豆后发生变化的特征。在一项随访研究（n = 16）中，对选定的代谢物进行了剂量-反应评估。分析揭示了745个1H-NMR谱区及318个LC–MS特征在食用青豆后随时间推移强度增加。其中3个1H-NMR代谢物和12个LC–MS代谢物与青豆摄入量的增加呈现剂量-反应关系（p <0.05），包括氨基酸缀合物（甘氨酸缀合物、N-苯乙酰谷氨酰胺）、羟基脱落酸葡萄糖醛酸苷和氨基羟基苯甲酸。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）以91.6%的准确率预测了青豆的低或高摄入量。研究人员鉴定了15种青豆尿液食物摄入生物标志物。一个生物标志物组合能够以良好的准确率将个体分类为低或高青豆消费者，这推进了改善膳食评估方法的持续努力。

论文解读

一、研究背景与目的

饮食是多种非传染性疾病（noncommunicable diseases）的重要可调控风险因素。地中海饮食模式可降低2型糖尿病（T2D）和心血管疾病（CVD）的发病风险，而终止高血压膳食疗法（DASH）饮食与较低血压相关。健康饮食的常见建议之一是大量摄入豆类（legumes），如豌豆、菜豆、扁豆、大豆、鹰嘴豆和花生。豆类提供植物蛋白、复合碳水化合物、微量营养素和植物化学物质，高豆类摄入与降低T2D、CVD、癌症和骨质疏松等慢性疾病风险相关。

鉴于豆类摄入的益处，准确评估个体或人群水平的豆类摄入量至关重要。然而，传统的膳食评估方法，如食物日记、24小时回顾和食物频率问卷，存在诸多局限性，包括误报、参与者负担、份量估算困难和回忆偏倚。食物摄入生物标志物（food intake biomarkers）作为更客观的膳食评估工具具有广阔前景，其定义为单独或组合使用、能够指示特定食物或食物组摄入情况、且在摄入后具有时间-反应和剂量-反应关系的代谢物。

目前已有多种豆类食物摄入生物标志物被提出：大豆异黄酮金雀异黄酮（genistein）和黄豆苷元（daidzein）是大豆摄入的强候选生物标志物；尿液葫芦巴碱（trigonelline）是豆类摄入的常用生物标志物；血清哌可酸（pipecolic acid）和S-甲基半胱氨酸（s-methylcysteine）可区分低和高干豆消费者。然而，尽管青豆（Phaseolus vulgaris，L.）——即菜豆未成熟豆荚——作为豆科植物中的重要蔬菜具有诸多健康益处，但目前缺乏针对青豆摄入的食物摄入生物标志物。

本研究旨在通过喂养试验和非靶向代谢组学方法，识别并评估青豆食物摄入生物标志物的剂量-反应关系，以推动食物摄入的客观测量，减少对自我报告数据的依赖。

二、研究设计与方法

研究人员开展了两项研究：发现研究（discovery study）和剂量-反应研究（dose–response study）。发现研究经都柏林大学学院人类研究伦理委员会批准，纳入27名健康成年人（平均年龄23.7±6.8岁，平均BMI 23.7±2.8 kg/m2），其中26人完成了青豆研究访视。参与者在隔夜禁食12小时后，于研究中心摄入240克熟青豆，并在食用后2、4、6小时及次日晨采集尿液样本。该研究同时涉及混合浆果和混合蔬菜作为对照食物，以评估生物标志物的特异性。

剂量-反应研究同样经伦理委员会批准，16名参与者（7男9女，平均年龄29.8±9.6岁，平均BMI 23.8±3.2 kg/m2）被随机分配至青豆组，采用交叉设计在3周内以随机顺序摄入低（27克）、中（108克）、高（169克）三种份量的青豆，每种份量连续食用4天，第5天收集空腹首次晨尿。14名参与者获得了三个份量的有效样本。

尿液样本采用两种互补的代谢组学平台进行分析。¹H-NMR波谱分析使用600 MHz Varian波谱仪，数据经Chenomx NMR Suite软件处理，共导出7500个谱区（bin宽度0.001 ppm），排除水区（4.0–6.0 ppm）。LC–MS分析采用Agilent LC-QTOF-MS系统，在正负电离模式下运行，使用分子特征提取器（MFE）算法提取特征，数据经MassProfiler进行化合物对齐和过滤。候选特征通过MS/MS获得结构信息，并与METLIN、CFM-ID和HMDB等数据库比对，按五级置信度标准进行鉴定。

统计分析方面，发现研究采用单因素重复测量方差分析（ANOVA）确定随时间变化的特征（FDR校正p <0.05），剂量-反应数据采用单因素重复测量ANOVA（p <0.05）。具有显著剂量-反应关系的代谢物的β加权z分数用于构建偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型，以分类低或高青豆消费者。

三、研究结果

3.1 与青豆摄入相关特征的识别

发现研究的¹H-NMR数据分析确定了1737个随时间点显著差异的谱区（FDR校正<0.05），其中745个谱区在青豆食用后强度增加。剂量-反应研究分析显示，14个谱区在低、中、高份量青豆之间存在显著差异（p <0.05），这些谱区对应3种代谢物：N-苯乙酰谷氨酰胺（N-Phenylacetylglutamine）、4-胍基丁酸（4-Guanidinobutanoate）及一个未知代谢物。

LC–MS数据分析获得713个正模式和908个负模式特征，其中637个特征（226个正模式、411个负模式）随时间点显著差异（FDR校正<0.05），318个特征在青豆食用后强度增加。剂量-反应分析确定26个特征（10个正模式、16个负模式）在低、中、高份量间存在显著差异（p <0.05）。提取离子色谱图（EIC）数据进一步分析显示15个特征具有显著剂量-反应关系，其中13个特征随份量增加而升高。一个代谢物在两种电离模式中均出现，因此13个特征对应12种代谢物。

3.2 反映青豆摄入的生物标志物

在LC–MS数据中，13个显著特征中有8个获得2级鉴定（ probable structure，匹配数据库或文献数据），其余7个被归为化合物类别（3级）或未知（4级）。鉴定出的代谢物包括：三高甲硫氨酸（trihomomethionine，2级）、己酰谷氨酰胺（hexanoylglutamine，2级）、3-羟基辛二酸（3-hydroxysuberic acid，2级）、羟基脱落酸葡萄糖醛酸苷（hydroxyabscisic acid glucuronide，2级）、3-羟基癸二酸（3-hydroxysebacic acid，2级）、5-(3E-戊烯基)四氢-2-氧代-3-呋喃羧酸（2级）、五高甲硫氨酸葡萄糖醛酸苷（pentahomomethionine glucuronide，2级），以及氨基羟基苯甲酸异构体（3级）、甘氨酸缀合物（3级）、未知三肽（3级）和多个未知代谢物（4级）。

3-羟基辛二酸（m/z 189.0767）在负电离模式中鉴定，其MS/MS谱与HMDB数据库预测谱匹配良好（相似度0.6434）。羟基脱落酸葡萄糖醛酸苷（m/z 455.154）的MS/MS谱显示从母离子到碎片离子m/z 279.1213的中性丢失约176.03 Da，表明丢失一个葡萄糖醛酸基（C₆H₈O₆），其余碎片与HMDB中13-羟基脱落酸的预测MS/MS谱匹配。3-羟基癸二酸（m/z 217.1079）的MS/MS谱与HMDB预测谱匹配（相似度0.7659）。

使用12种独特代谢物的β加权z分数构建的三个PLS-DA模型，Q2值均大于0.4，R2值介于0.70至0.82之间，三个测试集的平均正确分类率为91.6%。被误分类的样本均来自高青豆份量组。ROC分析显示，由3-羟基辛二酸、羟基脱落酸葡萄糖醛酸苷和一个未知代谢物组成的模型获得最高AUC值（0.95）。

四、讨论与结论

4.1 生物标志物的生物学合理性

本研究提出的多个生物标志物具有较高的生物学合理性。3-羟基辛二酸是一种中链羟基酸，与辛二酸（suberic acid）功能相关，而辛二酸已被报道存在于菜豆（Phaseolus vulgaris）和豌豆叶中，其化学式和MS/MS谱与此前报道的青豆食用后尿液代谢物一致。羟基脱落酸葡萄糖醛酸苷是青豆摄入的合理生物标志物，因为13-羟基脱落酸异构体已在豇豆中被报道。氨基羟基苯甲酸同样值得关注，因为青豆已知含有多种酚酸，包括羟基苯甲酸衍生物。

4.2 与已有豆类生物标志物的比较

本研究未发现一些既往报道的豆类生物标志物。大豆异黄酮金雀异黄酮和黄豆苷元未被发现，这并不意外，因为这些化合物被认为对大豆高度特异，且大豆中这些异黄酮的浓度远高于青豆和其他豆类。既往提出的血清生物标志物如哌可酸、S-甲基半胱氨酸、色氨酸甜菜碱和4-乙烯基苯酚硫酸盐未出现在尿液组合中，因为本研究使用尿液作为生物流体。葫芦巴碱在食用后样本中水平有所增加，但相对于基线的增加不显著，可能是青豆中葫芦巴碱浓度过低。本研究发现的多种氨基酸缀合物和衍生物（如4-胍基丁酸、N-苯乙酰谷氨酰胺、己酰谷氨酰胺、甘氨酸缀合物等）虽非青豆特异，但组合使用可能提供更准确的摄入量估计。

4.3 生物标志物组合的价值

近期研究强调需要生物标志物组合来捕捉食物摄入。咖啡摄入的16种生物标志物组合能以平均0.98的AUC区分咖啡消费者和非消费者，而仅2至5种生物标志物的不同组合表现更佳。红肉摄入的2至3种生物标志物组合在分类个体方面优于单一生物标志物或全部组合。本研究的青豆模型在预测低和高青豆消费者方面达到91.6%的总体正确预测率，与蔓越莓汁消费预测模型的准确率相当。此外，一项包含8种代谢物的潜变量模型被用于仅从生物标志物数据预测西兰花摄入量（克数），低摄入（73%）和中摄入（80%）具有良好一致性。

4.4 研究局限与优势

本研究的局限性在于无法对所有生物标志物代谢物进行全面鉴定——代谢物鉴定是代谢组学研究的已知瓶颈，原因是缺乏可用的真实标准品和MS/MS数据库中食物相关化合物有限。此外，剂量-反应研究中青豆在家食用，无法完全保证份量依从性，但研究采取了餐前餐后拍照和24小时回顾等措施促进依从性。研究优势包括：结合急性研究和剂量-反应研究确保识别稳健且响应的生物标志物；采用¹H-NMR和LC–MS多平台非靶向方法，可测量与青豆食用相关的大量代谢物；急性研究中青豆在受控环境中食用，剂量-反应研究在允许参与者保持日常饮食的同时采取了多项依从性保障措施。

4.5 研究结论

本研究成功应用多平台非靶向代谢组学方法识别了青豆摄入的食物摄入生物标志物，揭示了15种与青豆摄入同时具有时间-反应和剂量-反应关系的代谢物。生物标志物组合在将个体分类为低或高青豆消费者方面表现出良好能力。未来需要在不同人群中重复验证这些结果，并研究该生物标志物组合的应用。这项工作是对改善客观膳食摄入评估方法的重要补充。