PUS7介导7SK假尿苷化耦合BAF染色质重塑调控人体细胞重编程为iPS细胞

《Nature Chemical Biology》：PUS7 pseudouridylation of 7SK orchestrates human somatic cell reprogramming into iPS cells

　　

将人体细胞重编程为诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS细胞）在再生医学中潜力巨大，但其分子调控仍不完全清楚。本研究中，研究人员确定PUS7是一个促进多能性获得的RNA修饰检查点。PUS7缺失显著损害重编程，而其过表达可加速重编程效率与动力学。机制上，PUS7对染色质相关非编码RNA 7SK的U250进行假尿苷（Ψ）化，增强其与BRG/BRM相关因子（BAF）复合体的相互作用。该修饰丢失会破坏7SK–BAF关联，降低BAF染色质占据并减少全局染色质可及性。研究人员进一步建立PSKM（PUS7、SOX2、KLF4、MYC）重编程，产生具有忠实印迹、强健谱系潜力和改善发育保真度的iPS细胞。PSKM-iPS细胞可有效向神经与造血谱系分化，并发生原肠胚样形态发生。这些发现将7SK假尿苷化与染色质重塑联系起来，并建立PSKM作为制备高质量人iPS细胞用于建模与再生医学的框架。

研究背景方面，自Yamanaka因子OCT4、SOX2、KLF4、MYC（OSKM）建立人诱导多能干细胞（human iPS cells，hiPS细胞）体系以来，重编程依赖TET介导DNA去甲基化、EZH2等组蛋白修饰酶以及BRG/BRM相关因子（BAF）复合体等表观遗传网络。但OSKM单独使用常不能完全调动重塑机器，导致残留体细胞印迹与发育潜力受限。染色质重塑与DNA甲基化研究较多，而RNA修饰在重编程中受关注较少，染色质相关RNA（caRNAs）可局部调控染色质状态，假尿苷（Ψ）作为最丰富RNA修饰可影响RNA折叠、剪接与翻译。因此，研究人员探究假尿苷合成酶PUS7是否通过RNA修饰层调控人细胞重编程。

该研究发表于《Nature Chemical Biology》。研究人员发现PUS7缺失使人源体细胞重编程严重受损，过表达则加速重编程；机制上PUS7催化7SK小核RNA（snRNA）U250假尿苷化，增强7SK与BAF复合体结合，提高BAF染色质占据与染色质可及性；PUS7缺失使细胞停于refractory state，无法进入第二波多能性转录程序。研究人员进一步用PUS7替代外源OCT4，建立PSKM重编程，获得发育保真度更高、更接近人胚胎干细胞（hES细胞）的hiPS细胞。

主要关键技术方法包括：利用携带致病PUS7突变的个体来源淋巴母细胞样细胞系（LCLs）与成纤维细胞（FBs）及健康对照样本队列；对重编程多时间点进行转录组测序（RNA-seq）；用双硫氰酸诱导缺失测序（BID-seq）与BID-Amp-seq定位7SK Ψ250；以dCas13b-PUS7加7SK sgRNA实现靶向假尿苷化 rescue；以RNA免疫沉淀（RIP）、紫外RIP、CUT&Tag、ATAC-seq分析7SK–BAF互作与染色质状态；以全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）、全基因组测序（WGS）、小RNA-seq、类胚体（EB）与畸胎瘤评估印迹、基因组稳定性与三胚层分化能力。

研究结果如下。PUS7 is critical for human somatic cell reprogramming：研究人员用突变与对照体细胞行OSKM重编程，发现PUS7蛋白缺失导致NANOG⁺集落剧减，内源OCT4与NANOG无法激活；时序RNA-seq显示突变细胞通过第一波转录浪涌后，于第16天起偏离健康细胞，不能启动第二波多能性程序而进入refractory state；回补野生型PUS7而非催化死亡突变体可恢复集落形成，说明PUS7催化活性必不可少。

7SK snRNA Ψ250 is essential for reprogramming：研究人员用BID-seq比较野生型与PUS7敲除（KO）iPS细胞，从重编程上调且PUS7依赖的Ψ位点中锁定7SK U250；7SK丰度不变而Ψ250在iPS中升高、PUS7-KO中骤降；用sg7SK-dCas13b-PUS7在突变FB中恢复Ψ250可提高碱性磷酸酶（AP）⁺集落数，证明7SK Ψ250是PUS7促重编程的关键效应位点。

7SK Ψ promotes BAF binding and chromatin accessibility：研究人员通过RIP-BID-Amp-seq、体外ARID1A pull-down、CUT&Tag与ATAC-seq发现，Ψ250-7SK更易结合BAF亚基ARID1A、SMARCA4、SMARCD1、SMARCC1；PUS7-KO削弱7SK–BAF互作、BAF染色质占据及增强子/超级增强子区开放度，染色质趋于关闭；靶向恢复Ψ250可 Rescue BAF招募与可及性，表明7SK假尿苷化通过BAF复合体促进染色质开放。

PUS7 accelerates reprogramming：研究人员在OSKM中加入PUS7成OSKMP，发现集落更早出现、第16天即获得发育命运决定与原肠胚相关通路激活，并抑制炎症/干扰素反应，说明PUS7可克服重编程检查点、加快多能性获取。

PUS7 supports reprogramming in the absence of exogenous OCT4：研究人员以PUS7替掉外源OCT4行PSKM重编程，获得形态、核型正常、内源OCT4激活、三胚层分化能力的iPS细胞；BAF-KO削弱PSKM效率；用sg7SK-dCas13b-PUS7加SKM同样可获iPS细胞，证明该路径依赖7SK Ψ250且PUS7可功能性替代外源OCT4。

PSKM-iPS cells exhibit enhanced molecular similarity to hES cells：研究人员对同基因来源hES、OSKM-iPS、PSKM-iPS做RNA-seq、WGBS、WGS与小RNA-seq，发现OSKM-iPS在DLK1–DIO3印迹域的MEG3、MEG8、MEG9等母源表达基因异常高表达且MEG3位点低甲基化；PSKM-iPS使这些印迹基因表达与甲基化更接近hES细胞，DLK1–DIO3微RNA簇表达也更接近hES，γ-H2AX信号更低，提示基因组应激与表观遗传噪声更小。

讨论与结论部分总结：研究人员指出，传统OSKM重编程常遗留体细胞表观记忆，而PUS7–7SK–BAF轴代表一条此前未被认识的表观转录组到染色质重塑的调控轴。PUS7不是经tRNA翻译层，而是经7SK Ψ250稳定7SK–BAF结合、提高染色质可及性，从而允许内源OCT4、SOX2、NANOG网络第二波激活。PSKM框架首次以RNA修饰酶替代外源OCT4，在人系统中克服物种限制，产生印迹更忠实、增强子与超级增强子开放状态更合理、发育与分化能力更强的hiPS细胞。

研究结论翻译：研究人员确立PUS7为通过酶活调控人细胞重编程的RNA修饰检查点；PUS7催化7SK U250假尿苷化，强化7SK与BAF复合体相互作用，丢失该修饰会破坏7SK–BAF关联、降低BAF染色质占据并减少全局染色质可及性；研究人员建立PSKM（PUS7、SOX2、KLF4、MYC）重编程，生成具有忠实印迹、强健谱系潜力和改善发育保真度的iPS细胞，其可向神经与造血谱系高效分化并完成原肠胚样形态发生；这些发现将7SK假尿苷化与染色质重塑相联，并将PSKM确立为制备高质量人iPS细胞用于建模与再生医学的框架。