大口黑鲈lncRNA介导的ceRNA网络对LMBV感染期间免疫调节的贡献

《Microbial Pathogenesis》：The lncRNA-mediated ceRNA network of Largemouth Bass contribute to immune regulation during LMBV Infection

LMBV感染诱导头肾中lncRNAs、miRNAs和mRNAs的动态表达变化。通过整合多组学数据构建了全面的LMBV响应ceRNA网络。通过RT-qPCR验证了关键ceRNA相互作用并将其与免疫联系起来。ceRNA网络通过PI3K-Akt和TLR途径调控免疫基因，可能导致免疫抑制。

引言
大口黑鲈（Micropterus salmoides）原产于美国东南部，因其生长速度快、环境适应性强等优良特性，已成为全球水产养殖中的重要鱼类品种[1, 2]。在中国，大口黑鲈迅速崛起为主要养殖品种之一，2024年产量达到88万吨，占全球总产量的绝大部分[3]。然而，该产业的可持续发展受到传染性疾病的严重威胁，尤其是病毒性疾病，其致死率高且往往缺乏有效的治疗方法[4, 5]。在这些病原体中，大口黑鲈呼肠病毒（LMBV）尤为突出，是引起大口黑鲈呼肠病毒病（LMBVD）的主要原因，具有高毒力、易爆发和显著经济影响等特点[6]。虽然先前的研究已推进了我们对LMBV检测、疫苗开发以及宿主-病原体相互作用某些方面的理解——包括PI3K/ERK等信号通路在凋亡和复制中的作用[7]，以及广泛的免疫转录组学变化[8, 9]，但仍存在一个关键的认知空白。大多数研究集中于蛋白编码基因，而由非编码RNA（ncRNAs）编排的复杂转录后调控层在LMBV感染背景中基本未被探索[10, 11, 12]。

在抗病毒免疫中，基因表达不仅在转录水平受到精确控制，还通过复杂的转录后调控层进行调节。微小RNA（miRNAs）是该过程中的核心参与者，通过引导靶mRNA的序列特异性抑制来精细调节免疫和炎症反应的强度、时机和分辨率[13, 14]。在此基础上，一种更为精密的调控维度涉及长链非编码RNA（lncRNAs）。根据Salmena等人[15]首次提出的竞争性内源RNA（ceRNA）假说，lncRNAs可以通过竞争性结合共享的miRNAs作为分子海绵或ceRNAs发挥作用[16]。通过这种隔离作用，lncRNAs缓冲miRNA靶基因的抑制，建立了一种动态的、网络层面的交叉对话，为基因调控增添了一个关键的调控层。这一ceRNA机制为整个功能模块——如Toll样受体（TLR）/NF-κB、PI3K-Akt和JAK-STAT信号通路等——的协调控制提供了一个连贯的框架，这些通路是抗病毒防御的关键枢纽[17, 18]。越来越多的证据支持这一模型，表明lncRNAs经常通过竞争性结合共同的miRNAs来调控靶mRNAs，从而巩固了它们作为ceRNAs的功能角色[19]。

近年来，ceRNA概念已成为阐明硬骨鱼类免疫机制的一个有价值的框架。例如，在黄姑鱼（Miichthys miiuy）中，lncRNA NARL被证明可以作为miR-217-5p的ceRNA来增强炎症和抗病毒反应，从而缓解miRNA介导的对含核苷酸结合寡聚化域1（NOD1）表达的抑制[20]。同样，在大西洋鲑鱼中，miRNAs与其他非编码RNA共同调控靶基因的复杂相互作用被发现可以塑造针对胞内细菌病原体的免疫反应[21]。这些例子表明，全面表达谱和功能分析ncRNAs对于理解病毒感染期间的免疫反应至关重要。

鉴于ncRNAs作为硬骨鱼类免疫力的强效调节因子已确立其作用，在特定病原体挑战期间界定其调控网络尤为重要。然而，尽管大口黑鲈呼肠病毒（LMBV）造成严重的经济影响，但在LMBV感染期间lncRNA相关的ceRNA网络的架构、动力学和功能仍然完全未被探索。这一显著的认知空白限制了对宿主反应的系统级理解，并阻碍了发现针对这种毁灭性疾病的新的基于网络的调控靶标用于潜在的治疗或预防干预。

基于上述研究背景，我们假设在LMBV感染期间，大口黑鲈头肾中的某些lncRNAs可能通过竞争性结合共享的miRNAs来调控免疫相关mRNAs的表达，从而参与宿主抗病毒免疫、炎症调节和组织修复。具体而言，我们假设LMBV感染会诱导lncRNAs、miRNAs和mRNAs表达动态变化，且这些差异表达的转录本形成相互连接的ceRNA调控模块，其中lncRNAs作为miRNA海绵来调控关键免疫相关基因的表达。我们进一步假设这些ceRNA相互作用富集于经典的抗病毒信号通路——如TLR/NF-κB、PI3K-Akt和JAK-STAT通路中，且这些网络的失调可能有助于LMBV诱导的免疫抑制和受损的组织修复。基于这一假设，我们期望识别出与这些生物学过程相关的候选lncRNA-miRNA-mRNA调控模块，其表达关系与预期的ceRNA调控模型一致。为弥合这一空白，我们对头肾——硬骨鱼类的主要造血和主要免疫器官[22]——进行了整合全转录组分析。利用RNA-seq和miRNA-seq，我们在LMBV感染后多个时间点描绘了大口黑鲈中lncRNAs、miRNAs和mRNAs的动态表达景观。除了编目差异表达外，本研究旨在构建首个聚焦于免疫的LMBV响应lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络。我们鉴定并验证了核心调控模块，包括涉及枢纽miRNAs（miR-146-x、miR-155-x）和关键免疫基因（如TIRAP、AKT3、ANGPT4）的特定轴。此外，通过将这些ceRNA相互作用与经典抗病毒和组织修复通路联系起来，我们提出了一个新的机制性假设：LMBV可能利用或使ceRNA回路失调，从而有助于免疫抑制并阻碍组织恢复。这项工作将研究视角从以基因为中心转变为以网络为中心，为重要水产养殖物种的抗病毒免疫提供了基础性资源和关于转录后调控逻辑的新见解。

测序样本
本研究中使用的大口黑鲈呼肠病毒株FS2021（LMBV-FS2021）由我们实验室分离并保存[12]。所有实验用大口黑鲈（Micropterus salmoides）均购自中国广东省佛山市的一个鱼场，该鱼场没有传染病的历史记录。鱼被装在充气的塑料水袋中运送到实验室，随机选取五条鱼，使用商业qPCR试剂盒筛选常见鱼类病毒。

总RNA提取和质量评估
为确认测序样本的感染状态，测序前使用商业qPCR试剂盒定量头肾组织中的病毒载量。所有对照样本均为LMBV阴性，而所有感染样本均为阳性，在24、48和72 hpi时平均病毒载量分别为3.45×10?、6.40×10?和4.13×10? copies/mg。原始测序数据经过过滤以获得高质量数据。每组获得的原始reads数量范围在82,007,768到之间。

高通量测序在LMBV感染研究中的应用价值
凭借其每个样本可生成数百万条reads的能力，高通量RNA测序（RNA-Seq）能够以高分辨率探索转录组。除信使RNA（mRNA）外，RNA-Seq还可应用于广泛的RNA群体，包括总RNA、微小RNA和长链非编码RNA（lncRNA）。除了提供基因表达水平的精确量化外，RNA-Seq还提供了评估异构体丰度、鉴定新转录本和检测等的能力。

结论
本研究首次提供了大口黑鲈头肾在LMBV感染期间lncRNA介导的ceRNA调控景观的全面图谱。通过整合转录组数据，我们构建了一个聚焦于免疫的ceRNA网络并鉴定和验证了关键调控轴，如MSTRG.4391.5–miR-146-x–TIRAP。研究结果表明，lncRNAs可能作为协调的miRNA海绵来精细调节抗病毒免疫反应，可能有助于感染引起的免疫抑制。

CRediT作者贡献声明
钱王许：监督、调查。田颖：调查、形式分析。顾玉杰：监督、调查。刘宇：可视化、监督、形式分析。周杰：验证、监督。李奕飞：监督、调查。曾薇薇：可视化、资源、方法论、资金获取、数据整理、概念化。杨润：监督、软件、方法论、形式分析、数据整理。胡天美：验证、监督、方法论、调查。

伦理声明
本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经佛山大学动物护理和使用委员会批准（批准号：SYXK(粤)2020-0235）。

利益冲突声明
我们确认不存在可能不当影响本研究进行或结论的竞争财务或个人利益。任何产品、服务或公司的任何关联或利益均不被认为影响了本文的立场。

附加信息
GitHub仓库 https://github.com/uio-cels/Solbakken_RNAseq 包含本文的所有数据。测序数据可从ENA的PRJEB31369获取，补充序列作为转录组登录号PRJEB31396的一部分可获得。

伦理声明
所有动物实验程序均经佛山大学动物护理和使用委员会批准（许可编号：SYXK(粤)2020-0235）。

声明
我对工作的构思和设计或数据收集、分析或解释做出了实质性贡献；我起草了本工作或对重要学术内容进行了关键性修改；我已批准最终出版版本；我同意对本工作的所有方面负责，确保与工作任何部分的准确性或完整性相关的问题得到适当调查和解决。所有作出贡献的人均已声明。

利益冲突声明
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致谢
本工作获得了国家自然科学基金（32273169）、广西重点研发计划（桂科农AB2506910047）和广东省佛山市区域联合基金（2023B1515120074）的资助。

邹丁哲|杨润|胡天美|陈海跃|许钱王|田颖|周杰|李奕飞|顾玉杰|刘宇|谭鸿莲|卫新先|曾薇薇