球磨辅助基质固相分散结合基于深共晶溶剂的微乳液电动力色谱中的在线聚焦技术用于弱电离化合物的绿色分析

《Microchemical Journal》：Ball-mill-assisted matrix solid-phase dispersion combined with online stacking in deep eutectic solvent-based microemulsion electrokinetic chromatography for eco-friendly analysis of weakly ionized compounds

- 首次建立了一种新颖的环糊精辅助扫集-大体积样本堆叠-微乳液电动色谱（CD-sweeping-LVSS-MEEKC）多步堆叠策略。- 将球磨辅助基质固相分散（MSPD）与CD-sweeping-LVSS-MEEKC联用进行样品分析。- 球磨辅助MSPD提高了提取效率和重现性。- 深共晶溶剂（DES）作为微乳液体系中的绿色添加剂。- 与传统微乳液电动色谱（MEEKC）相比，灵敏度提高了188倍。## 引言毛细管电泳（CE）作为一种绿色、高效的分离技术，具有高效率、低样品/溶剂消耗和操作简单等优点[1]。然而，紫外检测由于进样量小、光程短而灵敏度低[2]，这尤其限制了复杂样品（如中药）的痕量分析以及弱离子化分析物的广泛应用[3]。因此，人们开发了多种在线富集策略来提高检测灵敏度，包括场放大样品堆叠（FASS/FASI）[4]、大体积样本堆叠（LVSS）[5]、动态pH结（DyPH）[6]、胶束-环糊精堆叠（MCDS）[7]以及扫集[8]等。其中，扫集依赖于分析物与假固定相之间的相互作用，该假固定相渗透进入样品区，其富集机制已得到广泛研究[9]；而LVSS则是基于在电场作用下长样品塞的压缩。作为扫集的重要变体，环糊精辅助扫集（CD-sweeping）已在胶束电动色谱（MEKC）体系中得到了系统研究[10, 11]。目前，毛细管电泳领域的研究趋势是结合多种堆叠机制，以突破任何单一技术的富集极限，这些策略通常与离线样品前处理相联用，以增强灵敏度并减少基质干扰。微乳液电动色谱（MEEKC）作为毛细管电泳的一种运行模式，对于复杂样品尤其具有吸引力，因为它采用热力学稳定的微乳液（油包水、水包油或双连续相）作为分离介质[12]，能够以高效率同时分离中性化合物和带电化合物[13]。在分离机制方面，MEEKC类似于胶束电动色谱（MEKC），然而，由于微乳液液滴的刚性较低且溶解能力更强，MEEKC通常能获得更优异的分离效率。此外，MEEKC的分离窗口比MEKC更易于调节，具有更广泛的适用性[14]。这些特性使MEEKC尤其适合于水溶性和脂溶性分析物的同时分离，非常适合疏水性物质的分析。虽然已有少量关于MEEKC中单步在线富集技术的研究，如FASS-MEEKC[15]、MCDS-MEEKC[12]和LVSS-MEEKC[16]，但在MEEKC体系内探索多步在线富集策略的研究目前在文献中几乎不存在。这一空白对于复杂基质的分析尤为关键，因为在这种情况下灵敏度的提高至关重要，这凸显了进一步方法创新的迫切需求。近年来，深共晶溶剂（DES）因其绿色特性（包括无毒、低挥发性、高热稳定性、低能耗和易于合成）在分析化学领域引起了广泛关注[17]。DES由氢键供体（HBDs）和氢键受体（HBAs）按特定比例混合形成，制备过程简单，只需按指定比例混合各组分即可[18]。迄今为止，DES已被广泛应用于样品前处理[19, 20]，在色谱领域也有一些应用；然而，其在毛细管电泳多步富集策略中的应用仍相对有限，特别是作为微乳液体系中的添加剂。 tougu止通散是一种传统中药方剂，由十余味草药组成，主要包括透骨草（Phryma leptostachya L.）、白浆草（Thlaspi arvense Linn.）和白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd.）。这三味草药约占方剂的半数，是该方剂发挥功效的主要物质基础，包括活血化瘀、消肿止痛和解毒等功效[21-23]。在其活性成分中，木犀草素、山奈酚、槲皮素和阿魏酸是重要成分[22, 24, 25]。因此，本研究旨在开发一种方法，同时定量测定tougu止通散中这些成分，为质量控制、工艺优化和类似复方中药制剂的标准化提供可靠数据。在中药复方等复杂基质的分析中，样品前处理对于确保分析准确性起着关键作用。其主要功能是净化样品并富集目标分析物，从而有效消除共存物质的干扰。基质固相分散（MSPD）[26]是一种源自固相萃取（SPE）的技术，通过将固体样品直接与吸附材料混合来简化前处理流程[27]。这种一体化方法在一个步骤中完成研磨、均质化、提取和净化，从而避免了传统液-液萃取中常见的乳化问题[28]。由于这些优势，MSPD特别适合于非均质和复杂固体样品的提取。球磨是一种利用机械力研磨、混合和粉碎固体材料的物理过程[29]，可以与MSPD联用，将样品组分均匀分散到吸附剂表面，形成均质混合物。通过用球磨替代MSPD中传统的研钵研磨，样品前处理过程可以实现自动化和标准化。这不仅显著提高了方法重现性，还进一步改善了目标分析物的提取效率[30]。已有研究表明，球磨有助于破坏植物细胞壁，从而提高了酚类化合物（包括黄酮类和有机酸）的回收率[31-33]。然而，迄今为止，尚无任何研究报告了球磨辅助MSPD在毛细管电泳多步富集程序中用于样品前处理。本文提出了一种新颖的在线富集方法——微乳液电动色谱中环糊精辅助扫集联合大体积样本堆叠（CD-sweeping-LVSS-MEEKC）。然后，将该在线方法与前处理的离线样品制备步骤（球磨辅助MSPD）联用，实现双重富集，从而能够高灵敏度地测定复杂中药制剂tougu止通散中四种生物活性成分（三种黄酮类和一种有机酸）。在该体系中，羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）被添加到样品基质中，而少量DES作为绿色添加剂加入背景电解质（BGE）中，替代了相对大量甲醇等有机溶剂。通过调节BGE的极性并改善溶解度，DES提高了分离效率，同时符合绿色分析化学的原则。离线球磨-MSPD提取和在线CD-sweeping-LVSS-MEEKC堆叠的关键参数通过单因素实验进行了系统优化，确保了整个系统的兼容性和协同整合，使灵敏度显著提高了188倍。此外，利用分析绿色度度量法（AGREE）对该方法的绿色度进行了评估，这是一种用于评估分析程序环境友好性的工具。## 各章节要点### 材料与试剂木犀草素、山奈酚、槲皮素和阿魏酸的对照品（纯度均高于98%）购自成都默斯特生物科技有限公司（中国成都）。其结构如图1所示。氢氧化钠（NaOH）和正丁醇购自天津永达化学试剂有限公司（中国天津）。磷酸（H₃PO₄）、乙二醇和无水甲醇由国药集团化学试剂有限公司（中国上海）供应。乙酸乙酯由……### CD辅助扫集-LVSS在MEEKC中的机制为实现在线富集，本研究建立了一种名为CD-sweeping-LVSS-MEEKC的样品堆叠技术。该技术在使用含SDS胶束的低pH值背景电解质的抑制阴极电渗流（EOF）条件下进行。富集和分离过程的示意图如图2所示。首先，毛细管完全填充含有大量微乳液液滴的背景电解质。随后，通过将稀释后的……### 结论本研究提出了CD-sweeping-LVSS-MEEKC作为一种新颖的双步在线富集策略，并将其与球磨辅助MSPD相结合，构建了高效的分析方法。该方法已通过验证，可同时定量测定复杂中药制剂及加标生物样品中四种生物活性成分（木犀草素、山奈酚、槲皮素和阿魏酸）。几项关键创新共同支撑了这一工作流程：样品的自动化和标准化处理……### CRediT作者贡献声明**Yaxin Cheng（程雅欣）**：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，验证，方法学，调查，数据整理，概念设计。**Wenli Sun（孙文丽）**：验证，方法学，调查，数据整理，概念设计。**Hangjuan Lin（林欢娟）**：资源，经费获取。**Zhijuan Duan（段志娟）**：写作——审阅与编辑，资源，概念设计。**Chu Chu（楚楚）**：写作——审阅与编辑，监督，资源，项目管理，经费获取，概念设计。### 利益冲突声明作者声明不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。### 致谢本研究得到中国国家自然科学基金（项目编号：82374017）、浙江省自然科学基金（项目编号：LY24H280007）和宁波市重点研发计划项目（项目编号：2023Z165）的资助。Yaxin Cheng | Wenli Sun | Hangjuan Lin | Zhijuan Duan | Chu Chu