单细胞多组学揭示OTUD7B是胰腺导管腺癌上皮重塑和免疫抑制微环境的核心驱动因子

《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Single-Cell Multiomics Reveals That OTUD7B Is a Central Driver of Epithelial Remodelling and the Immunosuppressive Microenvironment in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

胰腺导管腺癌（PAAD）以极端恶性和深刻治疗抵抗为特征，这在很大程度上由纤维化和免疫抑制肿瘤微环境（TME）驱动。OTU结构域含蛋白7B（OTUD7B）去泛素化酶已被提示参与炎症和致癌信号，但其在PAAD及其TME中的作用仍不清楚。本研究整合了来自GEO的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集和来自TCGA的bulk RNA-seq数据，以描绘PAAD的细胞生态系统，并采用细胞–细胞通讯分析、高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）和非负矩阵分解（NMF）识别OTUD7B相关模块和上皮亚群，同时评估OTUD7B在TCGA-PAAD队列中的生存和临床病理相关性。研究人员对OTUD7B敲除PAAD细胞进行定量蛋白质组学，并结合GO/KEGG和GSEA探索下游通路，通过解卷积算法推断免疫浸润，并通过OTUD7B、CD4和FOXP3多重免疫荧光染色进行验证。单细胞RNA-seq揭示上皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞扩增，伴有密集配体–受体网络，同时效应T细胞和NK细胞耗竭，表明向免疫抑制TME转变。hdWGCNA识别出上皮–ECM模块，其中OTUD7B作为枢纽基因，NMF揭示了一个OTUD7B高表达上皮亚群，该亚群富集糖基化相关代谢程序并位于恶性轨迹早期。OTUD7B在PAAD中显著上调，与更高分级、淋巴结转移和晚期相关，并预测较差总生存。OTUD7B缺陷细胞的蛋白质组分析揭示线粒体氧化磷酸化、ROS代谢和氧化还原稳态的广泛重塑。OTUD7B表达与M2巨噬细胞浸润、免疫调节基因表达和CD4⁺FOXP3⁺调节性T细胞蓄积正相关，组织染色进一步证实OTUD7B表达与Treg富集区域正相关。总之，OTUD7B作为关键整合节点，连接PAAD中的上皮重塑、线粒体代谢重编程和TME免疫抑制，作为不良预后生物标志物和潜在治疗靶点，可重塑肿瘤代谢并增强抗肿瘤免疫。

研究背景：胰腺导管腺癌（PAAD）是最致死性实体恶性肿瘤之一，具有起病隐匿、早期转移和对几乎所有治疗抵抗的特点，患者5年总生存仍不理想。常规基因组研究已揭示KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4等驱动突变，但将这些改变转化为有效治疗策略的尝试大多未成功。越来越多证据表明，除内在遗传病变外，高度复杂且免疫抑制的肿瘤微环境（TME）在PAAD起始、进展和治疗失败中发挥核心作用。PAAD的TME以密集促结缔组织增生基质为特征，由活化成纤维细胞、丰富细胞外基质（ECM）、异常血管和多样免疫细胞群组成；免疫浸润常偏向免疫抑制表型，包括肿瘤相关巨噬细胞、调节性T细胞（Treg）和功能失调T细胞，共同促进免疫逃逸。上皮、基质和免疫区室通过细胞因子、趋化因子、代谢线索和细胞接触相互串扰，塑造该生态系统。然而，支撑PAAD进展的细胞结构和通讯网络，以及协调上皮可塑性、基质重塑和免疫抑制的关键分子节点仍未完全明确。OTU去泛素化酶7B（OTUD7B，又称Cezanne）属于卵巢肿瘤（OTU）家族去泛素化酶，通过编辑特定底物上的K63和K11连接泛素链调节NF-κB、MAPK等信号通路，影响细胞存活、增殖和免疫反应。OTUD7B在多种肿瘤类型中表达失调，并可能在肿瘤生物学和免疫调节中发挥背景依赖作用。但OTUD7B在PAAD独特微环境中的表达模式、功能意义和机制影响仍大多未知，尤其其如何协调上皮重编程、线粒体代谢和免疫抑制TME尚不清楚。为此，研究人员整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）、非负矩阵分解（NMF）、bulk转录组、定量蛋白质组学和多参数免疫荧光，系统研究OTUD7B在PAAD中的作用。研究人员首先描绘PAAD和正常胰腺的细胞景观及细胞间通讯网络，揭示上皮、基质和免疫区室的深刻重塑；随后识别OTUD7B为上皮和ECM相关共表达模块中的枢纽基因，并定义具有代谢重编程特征的OTUD7B高表达上皮亚群。通过整合临床队列，研究人员证明OTUD7B在PAAD中显著上调，与侵袭性临床病理特征相关，并可预测较差总生存。机制上，OTUD7B缺陷细胞的蛋白质组和通路分析揭示线粒体氧化磷酸化、氧化还原稳态和免疫相关信号的广泛改变。最后，免疫浸润分析和组织水平验证显示，高OTUD7B表达与Treg和促肿瘤髓系细胞富集的免疫抑制微环境密切相关。这些发现将OTUD7B确立为PAAD上皮重塑和TME免疫抑制的关键协调者，并突出其作为潜在生物标志物和治疗脆弱点的意义。

主要关键技术方法：单细胞RNA测序数据来自GEO/ArrayExpress的PAAD和非肿瘤胰腺组织；bulk RNA-seq和临床病理信息来自TCGA和GTEx，经UCSC Xena获取，包括TCGA-PAAD队列和独立PAAD验证队列。研究人员采用Seurat、典型相关分析（CCA）或Harmony整合、主成分分析（PCA）、均匀流形近似与投影（UMAP）、Louvain聚类、Monocle3拟时序、细胞–细胞通讯、hdWGCNA、NMF、GO/KEGG和GSEA；用CRISPR/Cas9构建OTUD7B敲除PAAD细胞并进行定量蛋白质组学，同时构建过表达模型；用CIBERSORT/TIMER等解卷积算法推断免疫浸润，并用多重免疫荧光检测OTUD7B、CD4和FOXP3；还进行CCK-8、克隆形成、划痕、Western blot及ROS、MDA和SOD检测。

研究结果：
3.1 PAAD微环境中的细胞图谱与细胞–细胞通讯。研究人员整合并聚类单细胞转录组数据集，UMAP将细胞分为12个主要谱系，包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、NK细胞、组织干细胞、中性粒细胞和神经元，显示胰腺组织明显的细胞异质性。基于配体–受体对构建的细胞–细胞通讯网络显示，巨噬细胞、成纤维细胞和上皮细胞占据TME中心枢纽，并与多种谱系保持广泛串扰。肿瘤与正常组织相比，细胞间通讯数量和强度显著增强，尤其巨噬细胞与成纤维细胞之间、这些基质细胞与免疫谱系之间，以及上皮–免疫相互作用增强，提示肿瘤相关免疫抑制通讯模式。细胞组成分析显示，虽然T细胞总体占比最大，但PAAD样本中上皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞比例显著增加，而T细胞和NK细胞比例降低，表明TME从免疫活跃状态向免疫抑制状态转变，有利于肿瘤进展。

3.2 PAAD中细胞类型特异性基因特征与上皮细胞恶性转变。研究人员分析细胞类型特异性基因表达和通路富集，发现巨噬细胞高表达C1QC和MS4A4A，成纤维细胞高表达COL1A1和COL3A1，上皮细胞高表达KRT19和EPCAM，T细胞高表达GZMK和TRAT1。上皮细胞基因集富集分析显示细胞骨架组织、细胞–细胞连接和细胞–基质黏附相关通路显著富集，提示细胞可塑性和侵袭潜能增强。拟时序轨迹分析显示上皮细胞从正常样状态向恶性状态连续转变，OLFM4、ONECUT2、CDHR2和OTUD7B等基因表达动态变化，提示这些因子参与恶性进展和肿瘤细胞干性维持。差异表达基因UMAP可视化还显示免疫相关标志物TREM2、CLEC10A，肿瘤相关基因TPSB2、ADH1B，以及基质重塑因子COL1A1、LRRC15的异质性，强调PAAD生态系统的复杂性和可塑性。

3.3 以上皮重塑和基质活化为纽带、以OTUD7B为中心的共表达模块。研究人员对单细胞转录组进行hdWGCNA，将所有基因归入MP1–MP9等多个共表达模块。软阈值分析选择最佳power为8，以近似无标度拓扑并保持足够平均连接度。枢纽基因分析显示，棕色模块富集ECM重塑基因，包括COL1A1、COL3A1、FN1和OTUD7B；黄色模块富集免疫调节趋化因子，如CCL2、CXCL8和CXCL3；红色模块包含多个上皮相关基因，如EPCAM、KRT19和CDH1，提示参与肿瘤细胞黏附和迁移。模块表达比较显示turquoise、brown、blue和red模块在肿瘤上皮细胞中优先上调，提示其核心基因可能驱动PAAD进展。模块–模块相关性显示红色和棕色模块高度正相关，提示上皮转化与基质重塑协调。模块特征基因评分显示棕色模块及相关MP模块在上皮细胞中达峰。OTUD7B位于这些上皮和基质相关模块的交集，提示其连接上皮可塑性和ECM重塑。

3.4 NMF揭示OTUD7B驱动上皮细胞亚群及代谢重编程。研究人员对上皮细胞转录组应用NMF，揭示五个不同上皮亚群，其中EPI-OTUD7B-C1在PAAD中最丰富。对这些亚群的发育轨迹分析显示，OTUD7B表达在恶性轨迹早期达到峰值，提示OTUD7B可能参与上皮转化起始。功能富集分析显示，OTUD7B高表达上皮亚群与糖基化相关代谢过程和其他生物合成途径显著相关，提示OTUD7B驱动细胞发生代谢重编程，可能支持PAAD发展中的肿瘤生长和适应。

3.5 PAAD中OTUD7B过表达模式、临床病理关联及预后意义。泛癌分析显示OTUD7B在多种实体瘤中上调，PAAD中尤其高。TCGA-PAAD队列中，肿瘤组织OTUD7B mRNA表达显著高于正常胰腺组织。免疫荧光和免疫组织化学证实OTUD7B蛋白主要在肿瘤上皮区室表达，与PAAD上皮起源一致；肿瘤组织染色强度显著高于癌旁非肿瘤组织。OTUD7B表达随肿瘤分级增加，并在淋巴结转移患者中显著升高。按OTUD7B表达分层后，高表达患者倾向于更高分级和更晚期临床分期。Kaplan–Meier生存分析在TCGA队列和独立验证队列中均显示，高OTUD7B表达与较差总生存相关，表明OTUD7B是PAAD中稳健的不良预后生物标志物。研究人员还通过CRISPR/Cas9敲除或过表达OTUD7B构建同源细胞系。克隆形成和CCK-8实验显示，OTUD7B缺失几乎完全消除锚定依赖生长，而强制表达使增殖加快约两倍。划痕实验中，OTUD7B敲除显著延迟伤口闭合，过表达则加速迁移至接近完全愈合。这些数据表明OTUD7B促进胰腺癌细胞增殖和迁移/侵袭。

3.6 OTUD7B敲除后蛋白质组重塑突显线粒体与氧化应激通路。研究人员对OTUD7B敲除胰腺癌细胞进行定量蛋白质组学分析。热图显示OTUD7B缺失后全局蛋白质组重塑，代谢、炎症和细胞内信号相关蛋白广泛变化；火山图显示显著上调和下调蛋白，表明OTUD7B对细胞稳态具有广泛调控作用。GO注释和富集分析显示，OTUD7B缺陷影响氧化磷酸化、线粒体代谢、细胞黏附和免疫相关功能，并强调NADH脱氢酶复合体组装、线粒体呼吸链组织、氧化还原稳态和活性氧（ROS）代谢等过程富集，提示OTUD7B在线粒体功能和氧化应激调节中起核心作用。Sankey图和气泡图将受影响蛋白整合入通路网络，显示多个线粒体复合物组分，如NDUFS家族成员，汇聚于氧化磷酸化、代谢调节、产热和免疫相关信号。GSEA进一步显示，OTUD7B缺失后跨膜转运、质子偶联能量转换、电子传递链活性和NADH脱氢酶复合体功能相关通路富集。氧化应激指标验证显示，OTUD7B缺失显著加剧氧化应激，表现为MDA含量增加和ROS蓄积，同时SOD活性降低；相反，OTUD7B过表达降低MDA和细胞内ROS，并恢复SOD活性。这些数据表明OTUD7B通过限制脂质过氧化和ROS蓄积、增强细胞抗氧化防御能力来减轻氧化应激。

3.7 PAAD中OTUD7B相关免疫抑制微环境与调节性T细胞富集。研究人员在TCGA-PAAD队列中发现，OTUD7B表达与M2巨噬细胞、静息CD4记忆T细胞、静息树突状细胞和活化NK细胞浸润正相关，而与若干效应T细胞亚群表达负相关，符合免疫抑制环境建立。OTUD7B与包括共刺激和共抑制受体、趋化因子及其受体在内的免疫调节基因相关性矩阵显示，大多数这些分子与OTUD7B正相关，提示OTUD7B嵌入广泛免疫调节网络。代表性散点图进一步确认OTUD7B与M2巨噬细胞、静息记忆CD4⁺ T细胞和树突状细胞等关键免疫抑制细胞群强正相关。对构建细胞模型的蛋白质组数据进行CIBERSORT分析显示，OTUD7B缺失明显改变免疫景观；具体而言，活化NK细胞、γδT细胞和Treg增加，而B细胞（记忆和na?ve）、CD8⁺ T细胞和中性粒细胞呈下降趋势。多重免疫荧光染色显示，OTUD7B表达与CD4⁺ T细胞和FOXP3⁺调节性T细胞浸润正相关；高OTUD7B表达肿瘤中FOXP3⁺和FOXP3⁺/CD4⁺信号显著增加，而低表达肿瘤中这些细胞群浸润减少。此外，OTUD7B表达与FOXP3荧光强度正相关。这些发现表明OTUD7B缺失重塑免疫相关特征，支持其调节肿瘤免疫微环境的作用。

讨论部分总结：本研究整合单细胞转录组、共表达网络分析、NMF、蛋白质组学和临床数据，识别OTUD7B为连接PAAD上皮重塑、代谢重编程和免疫抑制微环境的中心节点。研究提示，PAAD微环境并非仅表现为免疫浸润减少，而是由OTUD7B高表达上皮亚群主动塑造，驱动“代谢–基质–免疫”耦联重编程，为肿瘤高度侵袭、差预后和免疫治疗反应有限提供合理解释。在细胞和转录水平，研究人员观察到上皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞显著扩增，配体–受体通讯高度活跃，同时效应T细胞和NK细胞减少，符合从免疫激活向免疫抑制状态转变。OTUD7B作为上皮–ECM共表达模块枢纽基因，标记早期上皮亚群，该亚群糖基化和其他代谢程序增强，提示其在肿瘤起始和早期演化中的作用。临床上，OTUD7B在PAAD中稳健过表达，尤其在高分级、转移和晚期肿瘤中，高表达与较差总生存一致相关，支持其作为预后生物标志物和风险分层模型的潜在组成。机制上，定量蛋白质组学显示OTUD7B敲除诱导广泛蛋白质组重塑，显著影响线粒体氧化磷酸化、电子传递、ROS代谢和氧化还原稳态，指出OTUD7B在控制肿瘤生物能量学和应激适应中的关键作用，进而可能影响肿瘤细胞与微环境互动和条件化。同时，免疫浸润分析和多重免疫荧光显示OTUD7B表达与M2巨噬细胞和CD4⁺FOXP3⁺调节性T细胞富集，以及多种免疫调节分子表达增加密切相关，勾勒出OTUD7B–Treg–免疫抑制轴，该轴可能解释PAAD对免疫检查点阻断的抵抗。研究局限在于工作主要为回顾性，缺乏系统体内验证和直接靶向OTUD7B。未来研究应鉴定PAAD中OTUD7B底物和信号伙伴，描述其在空间分辨微环境中的细胞类型特异性功能，并测试药物或遗传抑制OTUD7B能否重塑肿瘤代谢并缓解免疫抑制，从而将OTUD7B从生物标志物发展为可治疗脆弱点，以增强PAAD免疫治疗疗效。

研究结论翻译：总之，OTUD7B作为关键整合节点，连接PAAD中的上皮重塑、线粒体代谢重编程和TME免疫抑制，作为不良预后生物标志物和潜在治疗靶点，可重塑肿瘤代谢并增强抗肿瘤免疫。