G3BP1-应激颗粒轴在年龄相关性听力损失耳蜗毛细胞焦亡中的转录组学证据

《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Transcriptomics Implicates the G3BP1–SG Axis in Cochlear Hair-Cell Pyroptosis During Age-Related Hearing Loss

年龄相关性听力损失（ARHL）是听觉系统的退行性改变，但其潜在机制尚不明确。在本研究中，研究人员利用RNA测序技术，分析了易患ARHL的C57BL/6J（C57）小鼠与相对耐受的CBA/CaJ（CBA）小鼠耳蜗组织中mRNA的表达谱。研究发现，ARHL小鼠耳蜗组织中与应激颗粒（SG）相关的mRNA显著增加。结合当前关于耳蜗毛细胞焦亡的研究，研究人员在体外构建了House Ear Institute-Organ of Corti 1（HEI-OC1）细胞衰老模型，发现SG表达上调，而焦亡相关蛋白的表达呈现协同性上调。此外，针对G3BP1的敲低和过表达功能研究表明，应激颗粒通过负向调控HEI-OC1细胞的焦亡发挥保护作用。综上所述，本研究结果表明，随着衰老，SG的形成增加，焦亡相关标志物的激活增强。G3BP1的功能障碍进一步加剧了这些焦亡标志物，支持了在应激条件下SG稳态对抑制焦亡激活的保护作用。初步验证提示，SG-焦亡轴可能是调控耳蜗毛细胞焦亡的潜在靶点。

研究背景与科学问题

年龄相关性听力损失（age-related hearing loss, ARHL）是听觉系统的一种退行性病变，其特征为进行性、双侧对称的感音神经性听力损伤，严重影响患者的社交功能、沟通能力及生活质量，并带来巨大的社会经济负担。尽管已有研究指出ARHL的病理基础主要包括毛细胞（hair cells, HC）变性、血管纹萎缩及神经元丢失，但其确切的分子机制仍不清楚。在衰老过程中，耳蜗组织呈现出慢性低度炎症特征，这种持续的炎症压力可通过破坏氧化还原平衡、钙离子处理及线粒体功能，降低毛细胞的应激耐受性，加速感觉细胞功能障碍和丢失。细胞焦亡（pyroptosis）是一种溶解性的程序性细胞死亡方式，经典地与炎症小体激活相关，并以caspase-1依赖的炎性细胞因子加工及gasdermin D（GSDMD）切割为特征。已有研究在耳蜗衰老模型中观察到焦亡相关组分（如NLRP3、cleaved caspase-1和GSDMD-N）表达升高，但焦亡在ARHL中是毛细胞变性的起始事件还是继发性放大机制，仍存在争议。与此同时，应激颗粒（stress granules, SG）作为细胞内由RNA和蛋白质组成的动态凝聚体，在细胞应对胁迫时形成，能够保护转录本完整性并实现翻译重编程以适应应激。然而，以G3BP1为核心的SG轴是否参与ARHL，及其与耳蜗内焦亡程序的关联，尚未得到充分定义。因此，本研究旨在检验一个假设：在ARHL相关条件下，以G3BP1为中心的SG相关反应在转录水平上与焦亡激活相偶联。

研究方法与技术路线

研究人员首先建立了动物模型，选用9月龄的ARHL易感型C57BL/6J（C57）小鼠和相对耐受型CBA/CaJ（CBA）小鼠各5只，均购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，并在特定无病原体（SPF）条件下饲养。通过听性脑干反应（auditory brainstem response, ABR）评估两组小鼠在8、16、24和32 kHz频率下的听力阈值差异。随后，对耳蜗组织进行RNA测序（RNA-seq）及差异表达分析，筛选关键基因。在细胞层面，采用过氧化氢（H₂O₂）诱导HEI-OC1细胞建立氧化应激衰老模型，并通过衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色进行鉴定。关键技术包括：Western blotting检测蛋白表达、定量实时PCR（qRT-PCR）检测mRNA水平、免疫荧光染色观察蛋白定位、酶联免疫吸附测定（ELISA）检测IL-1β和IL-18分泌，以及通过siRNA介导的G3BP1敲低和质粒介导的G3BP1过表达进行功能验证。

研究结果

3.1 老年C57BL/6J和CBA/CaJ小鼠的听力表型差异及菌株相关的耳蜗转录组特征

ABR测试显示，与同龄CBA小鼠相比，C57小鼠在所有测试频率下均表现出显著升高的听阈。基于此功能差异，对两组耳蜗组织进行转录组分析。主成分分析（PCA）揭示了两组间转录组的明显分离。以预设标准共鉴定出3439个上调基因和3080个下调基因。GO和KEGG通路分析显示差异表达基因显著富集于核糖体和翻译相关过程，以及炎症和免疫相关通路。基因集富集分析（GSEA）进一步揭示了稳态相关基因集的富集。后续聚焦于SG核心调控因子G3BP1，RT-qPCR和Western blot结果显示，2月龄CBA和C57小鼠耳蜗G3BP1表达无显著差异，而9月龄C57小鼠的G3BP1蛋白水平显著高于同龄CBA小鼠，表明该差异随衰老显现。

3.2 H₂O₂诱导的HEI-OC1模型中应激颗粒和焦亡相关的变化

50 μM H₂O₂处理诱导HEI-OC1细胞产生衰老样表型，表现为SA-β-gal阳性细胞比例增加及p21蛋白表达升高。SASP相关因子IL-6和TNF-α的mRNA水平在72小时显著升高。同时，G3BP1表达在H₂O₂处理后两个时间点均显著增加。焦亡相关标志物GSDMD-N和cleaved caspase-1也在H₂O₂暴露后升高，其中cleaved caspase-1在36和72小时均显著增加，GSDMD-N在72小时显著增加。这表明H₂O₂诱导的衰老样变化伴随着G3BP1表达增加及caspase-1/GSDMD信号通路的激活。

3.3 G3BP1的功能调节揭示其在HEI-OC1细胞中对焦亡相关信号的保护作用

通过筛选，siRNA-2被选用于G3BP1敲低实验。在H₂O₂处理条件下，G3BP1敲低进一步增加了cleaved caspase-1和GSDMD-N的水平，表明caspase-1/GSDMD介导的焦亡信号加剧。此外，p21表达在36小时也因G3BP1敲低而进一步增加。相反，G3BP1过表达在72小时显著降低了GSDMD-N和cleaved caspase-1的水平。ELISA分析显示，G3BP1过表达在两个时间点均显著降低了IL-18水平，而IL-1β水平未见显著变化。免疫荧光分析进一步证实了G3BP1过表达后其荧光强度增加，而ASC荧光强度呈现降低趋势。这些双向功能研究结果共同支持了G3BP1在H₂O₂诱导的焦亡相关激活中发挥保护作用。

讨论与结论

讨论部分指出，本研究从对ARHL不同易感性小鼠品系的耳蜗转录组分析入手，发现易感品系中富集了SG相关生物学过程，并将G3BP1确定为候选分子。由于原始测序比较的是9月龄C57和CBA小鼠，无法完全区分品系特异性遗传效应与衰老相关变化。通过比较年轻和年老小鼠的G3BP1表达，发现年轻小鼠中无差异而年老小鼠中出现显著差异，提示该差异可能随品系依赖性听力损失易感性而发展。研究还讨论了SG在慢性应激环境中的双重作用，以及在衰老耳蜗中焦亡作为毛细胞损伤促进局部炎症放大的潜在机制。研究提出G3BP1/SG反应可能通过调控DDX3X、影响线粒体ROS等途径与炎症小体信号连接，但这些机制在ARHL中仍属假设。研究承认了局限性，包括缺乏年轻动物的原始测序数据、主要在HEI-OC1细胞中进行功能研究，以及需要在体内验证G3BP1对听力衰退的直接修饰作用。

研究结论翻译：本研究将G3BP1鉴定为一个与ARHL品系依赖性易感性相关的应激响应调节因子。耳蜗转录组分析揭示了在更易感的小鼠品系中，应激颗粒和翻译应激相关特征的富集，而细胞实验表明，长期的氧化应激伴随着G3BP1表达的增加以及caspase-1/GSDMD相关激活的增强。功能上，G3BP1敲低加剧了焦亡相关激活，而G3BP1过表达则减弱了这种激活并减少了IL-18的释放。总之，这些发现支持了G3BP1在耳蜗应激适应中的保护作用。未来的研究需要确定这种效应是否特异性地通过应激颗粒介导，并在ARHL进展过程中在体内验证其作用。