利用超临界流体色谱法分离、定量和纯化洛拉替尼及其对映异构体的对映体特异性方法

《Microchemical Journal》：Enantiospecific method for the separation, quantification, and purification of Lorlatinib and its enantiomer using supercritical fluid chromatography

　　

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  该方法实现了劳拉替尼及其对映体的鉴定、定量和纯化，使其在分析和制备规模上均具有潜在应用价值。
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  该方法简单、高效且经济，适用于常规分析。
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  该方法使用已建立的环境可持续性绿色分析指标进行评估。
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  该方法已成功放大至制备级超临界流体色谱（SFC），以实现高效纯化。

引言

劳拉替尼（LOR）是一种用于治疗间变性淋巴瘤激酶（ALK）阳性转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者的药物，适用于第二代ALK酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗失败后。非小细胞肺癌（NSCLC）占全球肺癌死亡病例的绝大多数。劳拉替尼是一种第三代ALK/ROS1酪氨酸激酶抑制剂，已获批准用于治疗ALK阳性非小细胞肺癌（NSCLC）。在III期CROWN临床试验中，劳拉替尼在ALK阳性晚期NSCLC未经治疗的患者中表现出优于克唑替尼的疗效。五年时，劳拉替尼的无进展生存（PFS）率为60%，而克唑替尼为8%；客观缓解率（ORR）分别为82%和57%。劳拉替尼表现出显著的颅内疗效，显著降低了中枢神经系统（CNS）病变发生的可能性，并为脑转移提供了持续管理，而脑转移是ALK阳性NSCLC患者发病的主要原因[1]。在一项加拿大观察性试验中，针对第二代ALK抑制剂治疗进展的患者，劳拉替尼表现出延长的疾病管理和保持生活质量的能力，从而增强了其在后续治疗线中的临床价值[2]。此外，一项涉及复发或难治性ALK驱动神经母细胞瘤的I期临床试验表明，劳拉替尼无论是单药治疗还是联合化疗，均表现出显著的抗肿瘤疗效，在特定患者群体中缓解率超过60%，凸显了其在肺癌之外的应用前景[3]。美国食品药品监督管理局（FDA）最初批准LOR用于肺癌的二线和三线治疗。2021年，LOR在显示出治疗结果显著改善后，获准用于一线治疗。劳拉替尼具有立体化学定义的巨环结构，手性甲基基团的引入促进了生物活性R-异构体的合成。相关的S-异构体表现出显著降低的ALK抑制活性[4]。因此，需要一种对映体特异性分析方法，在药物开发活动和常规分析中控制和定量不需要的对映体。定量LOR中的对映体对于确定药物的安全性和有效性并符合监管要求至关重要。手性对药物药代动力学和生物分析的影响强调了可靠的对映选择性分析方法对于手性药物的表征和定量是必要的。该研究强调了超临界流体色谱作为手性分离和生物分析应用中日益重要的技术[5]。已有报道开发并验证了一种HPLC-MS/MS方法，用于同时在人体K2-EDTA血浆中定量布格替尼、劳拉替尼、普拉替尼和塞尔帕替尼[6]。已讨论了使用核磁共振（NMR）在极性和非极性环境中确认巨环药物LOR的方法[7]。已有报道使用UPLC-MS/MS方法对人体脑脊液中奥希替尼、阿来替尼和劳拉替尼进行定量[8]。根据已报道的文献，仅报告了一种使用高效液相色谱进行劳拉替尼对映体分离的方法，该方法在Chiralpak IB柱上使用正己烷、异丙醇和二乙胺按85:15:0.1（v/v/v）比例的溶剂混合物实现分离[9]。本研究专注于使用超临界流体色谱（SFC）对劳拉替尼及其对映体进行对映体特异性方法的先进分析和制备应用。

超临界流体色谱（SFC）作为制药行业中分离和纯化手性异构体的替代方法[10]、[11]、[12]，凭借其分离效率提高、成本效益高和通量大的优势而脱颖而出。由于其对危险溶剂的依赖性较低，SFC被认为是一种更环保的方法。由于仪器的进步及其可扩展性，SFC已成为制药行业的一项强大技术。使用制备级SFC进行的手性分离已被广泛应用[13]、[14]、[15]，并有关于从分析应用到制备应用成功转换的记录[16]、[17]。此外，SFC在药物降解产物纯化方面也显示出有效性，适用于分析和制备两个层面[18]、[19]、[20]。尽管如此，从分析SFC过渡到用于对映体纯化的制备SFC，与液相色谱（LC）相比面临着不同的障碍。流动相密度、压力、温度和仪器设计的差异显著增加了放大过程的复杂性。因此，需要进一步优化以在制备规模上保持一致的保留因子和选择性。尽管存在这些复杂性，该方法仍成功放大用于LOR和LOR-E的纯化，表明其在分析和生产规模工作流中的能力。

在方法开发过程中，采用等度洗脱模式，使用各种有机改性剂（甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇和乙腈）来确定分离的最优选择性。在方法优化过程中，确定了最合适的有机改性剂以及最佳流速、温度和压力，以提高对映选择性。作为有机改性剂的醇类在不同手性固定相（CSP）上表现出不同的选择性。采用二氧化碳（CO?）和甲醇的等度洗脱经过优化，运行时间为20分钟。优化后的方法按照ICH指南进行了验证[21]。此外，该方法被证明适用于常规分析，并且根据分析方法的绿色度评分评估，与绿色化学原则高度一致[22]、[23]。开发的方法已成功放大至制备规模，使其能够在分析和生产规模上应用。劳拉替尼及其对映体的化学结构见表1。

章节摘要

化学品和试剂

劳拉替尼及其相关杂质在印度海得拉巴的Natco制药有限公司（NRC）合成。默克（印度海得拉巴）提供了HPLC级乙醇、丁醇、异丙醇和甲酸。J.T. Baker（印度海得拉巴）提供了HPLC梯度级甲醇和乙腈。从Spec Gases and Equipment（印度海得拉巴）采购了高质量二氧化碳（纯度99.99%）并配有插管。NMR溶剂DMSO-d?从美国剑桥同位素实验室采购。

有机改性剂的选择和等度洗脱。

众所周知，CSP和有机改性剂在SFC中起着至关重要的作用，能够实现最佳的非对映异构体分离效率。使用表S1中列出的CSP评估了有机改性剂的影响。等度洗脱在CO?与有机改性剂比例为85:15、80:20和75:25 v/v的条件下进行，其中CO?作为A相，有机改性剂（包括甲醇、异丙醇、乙醇、丁醇和乙腈）作为B相。使用特定的SFC操作条件

结论

成功开发、验证并应用了一种稳健且可扩展的SFC方法用于LOR和LOR-E的纯化。对固定化和涂覆手性固定相（CSP）的系统评估表明，醇类作为有机改性剂的选择显著影响了对映选择性，乙醇在所有CSP上都提供了良好的选择性。在使用甲醇或乙醇作为有机改性剂时，Cel-SC和Cel-SJ与其他CSP相比表现出更优异的对映选择性。

CRediT作者贡献声明

Saravana Kumar Meganathan：撰写——初稿，调查，概念化。Bijaya Ketan Sahoo：撰写——审阅与编辑。Ch. Naresh：数据整理。M. Rajesh：正式分析。Buchappa Gongalla：数据整理。K.M.V. Narayana Rao：正式分析。K. Ramakrishna：撰写——审阅与编辑。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在可能影响本研究工作的可识别的经济利益冲突或个人关系。

致谢

作者感谢NATCO制药有限公司授予进行研究工作的许可。作者感谢吉塔姆大学（Deemed to be University）理学院化学系（海得拉巴）对研究的协助。作者感谢分析研究部（ARD）和化学研究部（CRD）同事提供的重大帮助和协作。

Saravana Kumar Meganathan|Bijaya Ketan Sahoo|Ch. Naresh|M. Rajesh|Buchappa Gongalla|K.M.V. Narayana Rao|K. Ramakrishna