甲基化与结构变异在塑造大麦重组景观中的作用

《The Plant Journal》：The role of methylation and structural variants in shaping the recombination landscape of barley

摘要专业翻译 减数分裂重组不仅是真核生物有性适应的重要机制，而且对于育种群体中有益等位基因的积累至关重要。然而，有效操控重组需要更好地理解调控基因组中重组事件速率与分布的机制。在本研究中，研究人员以1 Mbp的分辨率鉴定出最能解释大麦（Hordeum vulgare）多样化分离群体间重组变异的基因组特征，并以10 kb的高分辨率研究了甲基化与结构变异（structural variants, SVs）如何决定交叉互换（crossovers, COs）热点与冷点。研究发现热点位于基因附近，未归因于甲基化的遗传效应是解释群体间重组率差异的最重要因素，其次是甲基化和亲本序列分歧度。有趣的是，冷点与仅从单亲遗传的高度甲基化基因组片段相关，而热点则出现在双亲均处于同等低甲基化水平的基因组区段。亲本序列分歧度与重组呈S形（sigmoidal）相关，表明同源染色体间错配存在形成CO的上限。研究发现SVs与CO抑制相关，且其类型和大小对该效应无显著影响。甲基化与SVs的联合作用与大麦冷点的定位相关，其相对效应权重取决于基因组区域。研究结果表明，大麦中的重组具有高度可预测性，主要发生在靠近基因的多个短片段区域，并受局部甲基化水平和SV负荷的调控。

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一、研究背景与科学问题

减数分裂重组是性生殖过程中产生遗传多样性的核心机制，通过同源染色体间的交叉互换（crossovers, COs）和非交叉互换（noncrossovers, NCOs）实现等位基因的重新组合，从而打破有益与有害突变之间的连锁，为自然选择和育种提供新的遗传组合。重组事件的发生速率和分布受到严格调控，且在不同物种乃至同一物种的不同群体间均表现出广泛的变异。然而，调控这种变异的机制尚未被完全阐明。理解这些机制对于有效操控重组、在育种中打破不利连锁并聚合优良等位基因具有重要的应用价值。

此前在植物中的研究已揭示若干与重组相关的基因组特征，例如重组事件倾向于发生在低甲基化的常染色质区域、基因附近，且与基因密度呈正相关。然而，不同研究之间也存在相互矛盾的结论，尤其是在重组率与亲本序列分歧度之间的关系上。此外，以往大多数植物重组研究的分辨率较低，难以精确刻画重组事件的精细分布。在大麦中，虽然已有低分辨率研究揭示了重组的遗传基础及其与环境和基因组特征的关联，但缺乏高分辨率下完整减数分裂重组景观及其与遗传和表观遗传特征关联的系统研究。

基于上述背景，本研究旨在：（i）鉴定最能解释遗传多样的大麦群体间重组变异的基因组特征；（ii）以10 kb的高分辨率检测大麦基因组中的重组事件；（iii）分析基因组特征在决定重组热点与冷点定位中的作用。

二、研究设计与技术方法

研究人员利用45个双循环轮交（double round-robin, DRR）大麦群体，该群体由23个亲本自交系按DRR设计杂交产生，覆盖栽培大麦的广泛遗传多样性。在低分辨率（1 Mbp）层面，利用50K Illumina Infinium iSelect SNP芯片的基因分型数据计算各群体的重组率，并结合全基因组重亚硫酸盐测序（whole-genome bisulfite sequencing）数据评估CpG、CHG和CHH三种序列背景下的甲基化水平，利用全基因组测序获得的单核苷酸变异（single nucleotide variant, SNV）数据计算亲本序列分歧度，并鉴定插入、缺失、倒位、重复和易位等结构变异（structural variants, SVs）。通过逐步回归模型筛选最能解释群体间重组率变异的基因组特征组合。

在高分辨率（10 kb）层面，从45个群体中随机选取三个相互连接的群体（HvDRR13、HvDRR27和HvDRR28），这些群体由HOR8160、SprattArcher和Unumli-Arpa三个亲本自交系两两杂交产生，分别包含64、92和79个重组自交系（recombinant inbred lines, RILs），培养至S7世代。研究人员采用mRNA测序（mRNA-seq）方法对RILs进行高密度基因分型，结合iSelect芯片数据，最终获得每群体约21.4万至25.9万个全基因组SNP，中位SNP间距仅为132 bp，较此前研究提高了79倍的分辨率。

三、主要研究结果

与大麦基因组重组率变异相关的基因组特征

在1 Mbp分辨率下，研究人员发现重组率在着丝粒周围区域较低，而在染色体远端区域较高，且远端区域基因密度更大。SV负荷和亲本序列分歧度均向染色体远端区域增加，与重组率呈正相关。CpG和CHG序列背景的甲基化水平在着丝粒周围区域达到最高并向端粒方向递减，与重组率呈显著负相关；CHH背景甲基化则向端粒方向增加，与重组率呈正相关。

与大麦群体间重组率变异相关的基因组特征

通过逐步回归模型分析，研究人员发现遗传效应是解释45个DRR群体间重组率差异的最主要因素，在远端区域（正效应0.70）和着丝粒周围区域（正效应0.27）均表现为促进作用。亲本序列分歧度与重组率在两个区域均呈正相关，但少数窗口呈现显著负相关，这些窗口的序列分歧度接近相对最大值，且与高SV负荷相关。甲基化水平与远端区域的重组率呈负相关，但在着丝粒周围区域相关性较低。扩展模型显示不同SV类型对群体间重组率变异无显著影响。

高分辨率检测重组事件的关键参数

三个群体经mRNA测序获得410万个序列变异，经与亲本DNA测序SNV数据比对后保留85.8万个SNP，加上iSelect芯片数据共约87万个SNP。每个群体的最终SNP数量为21.4万至25.9万个，中位SNP间距为132 bp。每个RIL平均积累的全基因组CO数量因标记块长度类别而异：长块（>3 Mbp）为30个，中块为87个，短块为269个。每个RIL平均积累的基因转换（gene conversion, GC）事件分别为58、251和6,521个（对应长、中、短GC相关块长度）。每个染色体平均发现56个重组热点窗口，其中12个位于着丝粒周围区域，其余位于远端区域。热点窗口在群体间的共享率较低（<10%），而冷点窗口的共享率较高（>60%）。

甲基化与结构变异对高分辨率重组率变异的影响

在三个分析群体中，冷点窗口的CpG和CHG甲基化水平显著高于同一区域内的其他窗口，而热点窗口的甲基化水平显著低于其他窗口。冷点窗口在端粒远端亚区域表现出显著更高的总SV负荷，而热点窗口的SV负荷与所在区域的其他窗口无显著差异。CO区间与插入/缺失及重复的重叠频率显著低于随机分布预期，CO断点与最近SV的距离显著大于随机预期，表明SVs与CO抑制相关。

热点与冷点区域周围的基因组环境

冷点区域的CpG和CHG甲基化水平及总SV负荷均显著高于其邻近（±40 kb范围内）的10 kb窗口。热点区域与邻近窗口在甲基化水平和SV负荷上无显著差异。热点窗口与基因的重叠显著高于随机分布预期，而冷点窗口与基因的重叠与随机分布无显著差异。在远端区域，42.5%的热点窗口与冷点窗口相邻。

大麦群体间冷点与热点窗口的甲基化和SV变异

三个群体在所有窗口及冷点窗口中的CpG和CHG甲基化水平存在显著差异，但热点窗口的甲基化水平在群体间无显著差异。类似地，总SV负荷在群体间的差异仅存在于所有窗口和冷点窗口中，热点窗口无显著差异。冷点窗口中两个亲本自交系在CpG和CHG序列背景的甲基化水平存在显著差异，表明仅一个亲本在特定基因组区域的高甲基化遗传可能足以在后代中产生冷点。热点窗口中亲本间无显著甲基化差异，表明双亲在特定基因组区段同等低甲基化是形成重组热点的必要条件。

热点窗口中的DNA基序丰度

研究人员比较了10 kb热点窗口与匹配的背景窗口中此前在拟南芥中报道的与交叉区域相关的DNA序列基序丰度。PolyA/T基序在热点窗口中显著富集，在远端和着丝粒周围区域分别高出约23%和19%；CTT/GAA和CT/GA基序在热点窗口中显著贫乏；CCN/GGN基序无显著差异。

四、讨论与结论

本研究表明，大麦中的重组具有高度可预测性。与以往研究一致，大部分重组发生在染色体远端区域的多个短的高重组片段中，这些重组热点位于基因附近，且甲基化水平和SV负荷足够低以允许CO形成。热点与长段缺乏重组的冷点区域交替出现，冷点的形成部分与甲基化水平升高或SV积累相关。群体间重组率的局部差异具有高度可遗传性，且可仅由杂交中一个亲本的效果决定。

研究首次在大麦中以10 kb高分辨率报道了全基因组CO热点，并首次表征了大麦中的GC事件。GC热点在群体间的共享率（>15%）远高于CO热点（1%），提示DSB位点可能在物种内高度保守，而CO的速率和分布则存在广泛的种内变异。

在基因组特征方面，未归因于甲基化的遗传效应是解释群体间重组率差异的最重要因素，研究人员推测这可能与重组机制相关基因的效应有关。亲本序列分歧度与重组呈S形相关，表明同源染色体间存在错配上限，超过该上限后高多态性会因错配增加而抑制CO形成。SV负荷在粗分辨率下未显示为群体间重组差异的决定因素，但在精细尺度上，CO断点与SV的距离显著大于随机预期，证实SVs对CO的抑制作用，且该作用与SV的类型和大小无关。

甲基化方面，CpG和CHG背景甲基化与重组率在粗尺度上呈显著负相关，并在高分辨率下得到验证。冷点窗口与单亲高甲基化遗传相关，而热点窗口需要双亲同等低甲基化。甲基化和SVs的联合作用共同决定了大麦中着丝粒周围区域以外的冷点定位，且两者的相对效应权重因基因组区域而异。

此外，PolyA/T基序在热点窗口中的富集与拟南芥中的报道一致，提示这些序列特征可能在不同植物物种间对重组热点的形成或定位具有保守的贡献；而CTT/GAA和CT/GA基序的贫乏则表明这些基序与重组的关联并非跨物种保守。

综上所述，本研究全面评估了与大麦基因组重组率差异相关的基因组特征，揭示了甲基化、结构变异和遗传效应在塑造大麦重组景观中的协同作用，为理解植物重组调控机制和育种中有效操控重组提供了重要的理论基础。