《PROTEOMICS》：Proteomic Analysis of Mixed Cell Membrane Extracts From Triple-Negative Breast Cancer Cell Lines Revealed Broad Metabolic Reprogramming Associated With Tumor Progression
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三阴性乳腺癌（TNBC）是最具侵袭性的亚型，治疗选择有限且临床结局最差。研究人员使用高分辨率nUPLC-QTOF-MS/MS，对代表疾病进展阶段的TNBC细胞系进行了全面蛋白质组学分析：HCC-1937（IIB期）、HCC-1599（IIIA期）和MDA-MB
三阴性乳腺癌（TNBC）是最具侵袭性的亚型，治疗选择有限且临床结局最差。研究人员使用高分辨率nUPLC-QTOF-MS/MS，对代表疾病进展阶段的TNBC细胞系进行了全面蛋白质组学分析：HCC-1937（IIB期）、HCC-1599（IIIA期）和MDA-MB-231（IV期），并以非致瘤性MCF-12F细胞为基准。从最初检测到的11,864种蛋白质中，经质量过滤保留5,623种高置信蛋白质，跨度达六个数量级。差异丰度蛋白（DAPs）分析识别出不同的分期相关蛋白质组学谱，分别在HCC-1937、HCC-1599和MDA-MB-231中发现381、490和550个DAPs，三种TNBC细胞系之间无共享DAPs。稀疏偏最小二乘判别分析（sPLS-DA）和k-means聚类分析显示TNBC细胞系具有明显聚类模式。STRING网络拓扑分析揭示了氧化磷酸化（OXPHOS）、线粒体电子传递链复合体中的失调枢纽，包括HCC-1937和MDA-MB-231细胞中复合体I（NDUFB3、NDUFB9、NDUFB10、NDUFB11）、复合体III（UQCRC1、UQCRC2、UQCRB、UQCRFS1）和复合体IV（COX4I1、MT-CO2）的多个亚基，以及糖酵解酶和细胞骨架重塑蛋白。功能富集分析显示代谢途径显著改变，包括糖酵解相关蛋白协调上调和OXPHOS相关蛋白下调。癌症标志性特征分析发现所有TNBC阶段均富集组织侵袭/转移（FDR < 0.001）、免疫逃逸、基因组不稳定性和炎症信号。发现线粒体核糖体蛋白MRPL24、MRPL49、MRPL58、MRPS18B和MRPS34下调，这可能损害多个TNBC细胞系中功能性呼吸链复合体的组装，为观察到的OXPHOS抑制提供了机制性见解。此外，线粒体加工肽酶PMPCA以及线粒体输入机器成员TOMM22和TIMM10的协调下调也导致线粒体功能受损。这些分期分辨的蛋白质组学景观为TNBC进展提供了机制性见解，并识别了精准肿瘤学（precision oncology）的潜在治疗脆弱性和预后生物标志物候选物。数据通过ProteomeXchange提供，标识符为PXD071351。
论文主体解读
乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一。三阴性乳腺癌（TNBC）缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2），内分泌治疗和HER2靶向治疗无效，系统化疗是主要治疗手段，且该亚型预后差、复发率高。TNBC在病因、分子病理和临床结局上高度异质，Lehmann等曾将其分为basal-like 1（BL1）、basal-like 2（BL2）、mesenchymal（M）和luminal androgen receptor（LAR）等亚群。蛋白质组学可表征细胞蛋白质全谱及翻译后修饰，无标记定量（LFQ）通过测量酶解后肽段的数目和强度来评估蛋白相对丰度，具有简便、适用广和高通量特点。既有研究多分析总细胞提取物、SILAC标记后的质膜蛋白或特定细胞器，较少关注癌细胞混合膜组分（MMF）。因此，研究人员选择不同TNM分期的TNBC细胞系MMF，与健康乳腺细胞系比较，以发现潜在生物标志物和治疗靶点。
研究人员使用HCC-1937（IIB期，3级）、HCC-1599（IIIA期，3级）、MDA-MB-231（IV期，3级，低Claudin表达）三种TNBC细胞系，以及非转化MCF-12F乳腺细胞系，所有细胞系均来自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。研究得出：在TNBC进展中存在分期特异蛋白质组学特征，DAPs无共享，代谢重编程、OXPHOS抑制、糖酵解上调、细胞骨架重塑和免疫调节是核心改变；这些结果为精准肿瘤学提供了潜在治疗脆弱性和预后生物标志物候选物。
为开展研究，关键方法包括：获取ATCC来源的上述四种细胞系；制备混合膜组分（MMF），采用低渗缓冲液、匀浆、差速离心和超速离心；去脂后进行nUPLC-QTOF-MS/MS，结合离子迁移UDMSE和数据非依赖采集（DIA），用Progenesis QI对UniProtKB人蛋白质数据库搜索，并基于LFQ/Top3定量；用MetaboAnalyst进行sPLS-DA，用R进行k-means聚类；用edgeR和DESeq2鉴定DAPs；用STRING、shinyGO和Cancer Hallmarks进行网络、功能及标志性富集分析。样本来源为ATCC细胞系，无患者队列。
研究结果如下。
3.1 三阴性乳腺癌细胞系混合膜组分的获得与蛋白质组学分析质量控制。研究人员制备MMF并进行质谱分析，最初鉴定1,861,246个肽段，筛选高置信肽段1,532,490个，其中82.34%质量误差在±10 ppm内；共鉴定11,864种蛋白质，质量过滤后保留5,623种高置信蛋白质，覆盖六个数量级的动态范围。
3.2 稀疏偏最小二乘判别分析（sPLS-DA）。sPLS-DA显示各细胞系可分离，HCC-1937与MDA-MB-231较接近，HCC-1599与MCF-12F明显分离；成分1和成分2分别解释24.5%和13.5%的总方差。
3.3 研究乳腺细胞系中蛋白丰度的火山图。与MCF-12F相比，HCC-1937中381个DAPs（212个上调、169个下调），HCC-1599中490个DAPs（235个上调、255个下调），MDA-MB-231中550个DAPs（246个上调、304个下调）；其他比较中，HCC-1937与MDA-MB-231有137个DAPs，HCC-1599与MDA-MB-231有1,180个DAPs，HCC-1937与HCC-1599有859个DAPs。
3.4 通过k-means对差异丰度蛋白进行层次聚类。k-means聚类最佳k值为2，热图显示前300个高变蛋白形成两个簇；簇1在MCF-12F、HCC-1937和MDA-MB-231中上调，在HCC-1599中下调；簇2除HCC-1599上调外，在其他细胞系中下调。
3.5 通过STRING功能蛋白关联网络数据库在乳腺癌细胞系与MCF-12F健康乳腺细胞系比较中识别DAPs相互作用网络。
3.5.1 HCC-1937与MCF-12F比较。上调网络涉及微管蛋白、糖酵解酶GADPH、GAPDHS、LDHC、ME1、角蛋白、SQSTM1、MAP1S、JAK3、CD163、NCAM1、PTPRC等；下调网络涉及复合体I、III、IV亚基、ATP合酶亚基、OGDH、GLUD1、ALDH18A1、线粒体核糖体蛋白、SOD2、STAT4等；另有EXOC1/5/6B、ANP32A/B等小网络。结论是HCC-1937中氧化磷酸化和线粒体相关蛋白下调，糖酵解和细胞骨架相关蛋白上调。
3.5.2 HCC-1599与MCF-12F比较。上调网络涉及PRDX5、PRDX2、PRDX6、TPIS、G6PI、PGM2、PRPS3、PEBP1、ACO2、FH、ASNSD1、CPS1、ASS1、PHGDH、MTHFD1L、ATIC、NPM1、HNRNPA1、STAT3、ANXA5、CALR、HLA-B、HMGB1、PDIA1、COL4A4、GPNMB、CD44、COL2A1、CBL、YWHAZ等；下调网络涉及POR、CYB5B、SCD、CPT1A、ACSL3、ACSL4、HADHA、ACAA2、ACAD9、ETFB、OGDH、SDHA、NDUFS8、PMPCA、MT-CO2、POLG、GPD2等，以及EXOC1、RAB8A、CAV3、CAVIN1、ANXA2、ENO1、ENO3、TLR2和翻译/核糖体相关蛋白。结论是HCC-1599呈现代谢、黏附和免疫相关改变，线粒体及脂质代谢蛋白下调。
3.5.3 MDA-MB-231与MCF-12F比较。上调网络涉及ADGRF5、A2M、ANPEP、AZGP1、ALB、TLR2、RIPK2、AKT1、ADCY6、NTPCR、PDE2A、ATF6B、BCAR1、NQO1、GSTP1、ALDH3A1、FSCN1、LCP1、STAT4、SOD2，以及线粒体核糖体蛋白、线粒体输入和呼吸链相关蛋白如ATP5PB、PMPCA、CYC1、NDUFA4、MT-CO2、TOMM22、TIMM10、UQCRC2、UQCRFS1、COX4I1、UQCRB、NDUFS3、NDUFB3/10/11等；下调网络涉及PPL、KRT8、SQSTM1、OPTN、MAP1A、ISG15、IFI44、SAMD9L、IFIT2、IFIT1、SAMHD1、RNASEH2B、FLNB、GSN、FLNC、CAPN3、GAPDH、B2M、SLC2A1、NRP1、CD63、SDCB、PTPRC、JAK3、NCAM1、TUBB2、TUBB、MAPRE1、TUBB4A、TUBB3、KIF21A，以及CDC23、BRCA2、ATRX、H2AZ1、BRD2、SMARCC1、KPNA2、HDAC10、KDM6A、UTY、KDM5D等。结论是MDA-MB-231具有显著代谢、氧化应激和免疫相关改变，同时细胞骨架和干扰素相关网络下调。
3.5.4 三个乳腺癌细胞系中上调与下调DAPs的Venn图。与MCF-12F相比，上调DAPs无三者共享；HCC-1937与HCC-1599共享28个，HCC-1599与MDA-MB-231共享6个，HCC-1937、HCC-1599、MDA-MB-231独有分别为184、201、240个。下调DAPs也无三者共享；HCC-1937与HCC-1599共享34个，HCC-1599与MDA-MB-231共享12个，三者独有分别为135、209、291个。结论是TNBC细胞系间蛋白质组异质性显著。
3.5.5 乳腺癌细胞系与MCF-12F相比DAPs的GO功能富集分析。HCC-1937富集髓系细胞分化负调控、巨核细胞分化、蛋白定位到染色质和着丝粒区、染色质组织等，富集倍数约10至50倍；HCC-1599富集细胞内运输、小分子代谢、蛋白定位建立、有机磷酸代谢、有机酸代谢、羧酸代谢、单羧酸代谢、细胞-基质黏附调控等，富集倍数1.46至5.13倍；MDA-MB-231富集有机化合物氧化能量获取、ATP代谢、细胞呼吸、电子传递链、有氧呼吸、ATP合成偶联电子传递、OXPHOS、呼吸电子传递链、有氧电子传递链、线粒体电子传递泛醇到细胞色素c等，富集倍数2.82至17.87倍。结论是MDA-MB-231能量代谢富集最突出。
3.5.6 KEGG功能富集分析。HCC-1937富集产热、酒精中毒、糖尿病心肌病、糖酵解/糖异生、中性粒细胞胞外诱捕网形成、非酒精性脂肪肝、心肌收缩、病毒致癌、系统性红斑狼疮、OXPHOS等，富集倍数4.85至7.47倍；HCC-1599富集代谢通路、黏着斑、内质网蛋白加工、碳代谢、细菌侵袭上皮细胞、脂肪酸代谢、PPAR信号通路、氨基酸生物合成、脂肪酸降解等，富集倍数1.85至7.02倍；MDA-MB-231富集糖酵解/糖异生、非酒精性脂肪肝、亨廷顿病、心肌收缩、化学致癌-活性氧、碳水化合物消化吸收、糖尿病心肌病、OXPHOS、组氨酸代谢、β-丙氨酸代谢等，富集倍数4.09至8.88倍。结论是代谢途径改变是共同主题。
3.5.7 乳腺癌细胞系与MCF-12F相比DAPs的Hallmark富集分析。HCC-1937主要富集能量代谢重编程、肿瘤促进炎症、组织侵袭和转移、逃避免疫破坏、基因组不稳定性；HCC-1599富集复制永生、能量代谢重编程、肿瘤促进炎症、组织侵袭和转移、持续血管生成、基因组不稳定性；MDA-MB-231富集能量代谢重编程、肿瘤促进炎症、组织侵袭和转移、逃避免疫破坏、基因组不稳定性。结论是各阶段均富集侵袭/转移、炎症、基因组不稳定性和代谢重编程。
讨论部分总结：研究人员指出TNBC存在显著分子异质性，三种TNBC细胞系DAPs无共享，挑战了TNBC作为单一疾病实体的观点。sPLS-DA中HCC-1937接近MDA-MB-231，HCC-1599独特，提示分子特征可能超越传统TNM分类。线粒体蛋白和能量代谢通路系统失调，OXPHOS复合体I、III、IV亚基下调，糖酵解酶上调，支持Warburg效应。线粒体核糖体蛋白MRPL24、MRPL49、MRPL58、MRPS18B、MRPS34下调，以及PMPCA、TOMM22、TIMM10下调，提示线粒体蛋白合成、输入和生物发生受损。细胞骨架蛋白、角蛋白上调反映迁移和侵袭能力，SQSTM1参与自噬、氧化应激和生存。Hallmark富集显示组织侵袭/转移、肿瘤促进炎症和基因组不稳定性在三种TNBC中一致，免疫逃逸相关蛋白和干扰素诱导蛋白提示免疫-肿瘤相互作用。NQO1、GSTP1、脂肪酸代谢酶等为潜在治疗靶点；PHGDH、ENO1、GSTP1、CD44等与TNBC侵袭性、代谢适应和化疗耐药相关。局限性在于细胞系模型不能完全重现肿瘤异质性、基质相互作用和微环境，未来需患者样本验证、多组学整合和功能验证。研究人员还提到HCC-1599与MDA-MB-231仅共享6个上调蛋白，包括ALDH1A3、MECOM、CKMT1B、RPL22L1、KAT14和TATDN1，并讨论了它们在肿瘤增殖、耐药、代谢和核糖体功能中的可能意义。
研究结论翻译：总之，研究人员的高分辨率蛋白质组学分析揭示了TNBC进展中的分期特异性分子特征，其特征在于与TNBC进展相关的显著代谢改变、线粒体功能障碍、细胞骨架重塑和免疫调节。这些发现为生物标志物发现和识别这种具有挑战性疾病中的治疗脆弱性提供了丰富资源。TNBC亚型之间观察到的蛋白质组异质性强调，迫切需要用全面分子分析指导的精准医学方法来改善这种侵袭性恶性肿瘤患者的结局。
