《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：Fully automated robotic sample preparation coupled with UPLC-MS/MS for high-throughput screening of 19 nitazene analogues in human urine
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•开发了全自动机器人样品前处理平台与UPLC-MS/MS联用技术，用于尿液中19种尼他泽系列类似物的分析。•该系统可在14.9小时内无人值守批量处理48个样本，与手动操作相比，单样本处理时间减少了53.5%。•每个样本仅需消耗400 μL甲醇，具有优异的环境友好性。•该方法表
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开发了全自动机器人样品前处理平台与UPLC-MS/MS联用技术，用于尿液中19种尼他泽系列类似物的分析。
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该系统可在14.9小时内无人值守批量处理48个样本，与手动操作相比，单样本处理时间减少了53.5%。
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每个样本仅需消耗400 μL甲醇，具有优异的环境友好性。
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该方法表现出良好的精密度（日内RSD：1.2-7.0%；日间RSD：0.6-5.1%）和批次间重现性。
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适用于尼他泽系列类似物的高通量法医筛查和公共卫生监测。
引言
全球阿片类药物危机的持续演变伴随着新型合成阿片类药物的不断涌现，对公共卫生和法医鉴定构成了重大挑战[1], [2]。近期，尼他泽系列类似物——一类2-苄基苯并咪唑衍生物，最初于20世纪中叶合成——已成为一个重要的关注点[3], [4]。尼他泽类药物于2019年重新出现在非法毒品市场中，异妥尼他泽是欧洲和北美最早被鉴定出的类似物之一[5], [6]。药理学研究表明，多种尼他泽系列类似物的效力超过芬太尼[3], [7]，即使在低剂量下也导致严重的致死性过量的风险[8], [9]。瑞士、法国等多个地区已报告多起与这些化合物相关的致死性中毒事件[10], [11]。面对这一新兴威胁，国际和国内监管机构实施了日益严格的管控措施。氯尼他泽和依托尼他泽于1961年被联合国列入国际管制[12]。近期，联合国毒品和犯罪问题办公室（UNODC）已将包括脱硝依托尼他泽、依托尼他嗪和丙酮尼他泽在内的更多尼他泽类物质列入管制目录。在中国，氯尼他泽和依托尼他泽已被纳入《麻醉药品品种目录》（2013年版），异妥尼他泽随后被列入《非医疗用麻醉药品和精神药品补充目录》。2025年，中国对尼他泽类药物实行了全类管制。为应对对尼他泽类药物系统性监测的需求，我们建立了尼他泽监测项目，并开发了一种快速、灵敏、自动化的尿液检测方法用于其测定。
尿液是药物监测的首选样本，因为它可以无创采集，且通常比其他许多生物样本含有更高浓度的药物代谢物[13], [14]。然而，尿液中尼他泽类药物的分析具有挑战性，因为基质中含有尿素、肌酐、盐类和其他内源性成分，这些成分可能导致离子抑制并干扰色谱分离[15], [16]。因此，在进行超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析之前，合适的样品前处理程序至关重要。Wachelko等人开发了一种在pH 9下使用乙酸乙酯的液-液萃取（LLE）方法，用于全血中26种尼他泽类药物的测定[17]。Walton等人采用2-氯丁烷/乙酸乙酯溶剂混合物萃取了8种尼他泽类药物和4种代谢物[18]。尽管这些方法提供了令人满意的萃取效率，但LLE通常每个样本需要2-3 mL有机溶剂，并涉及多个手动操作，包括涡旋振荡、离心、蒸发和复溶。UCT发布的一份应用说明报告了一种使用Clean Screen? DAU柱（3 mL，130 mg）的固相萃取（SPE）程序，用于尿液和血液中9种尼他泽类药物的选择性富集[19]，提供了有效的基质净化，但仍需额外的人工操作。液相微萃取（LPME）可以减少溶剂消耗，但通常仍涉及手动或半自动操作，这可能会限制通量和重现性[20], [21]。蛋白沉淀（PPT）是一种简单且广泛使用的生物分析样品前处理技术，因为其操作简单、成本低且回收率通常令人满意[22], [23], [24], [25]。在PPT中，有机溶剂被添加到生物样本中以沉淀蛋白质，而目标分析物则保留在上清液中供后续分析[26]。
对更高分析通量和更大流程一致性的需求推动了自动化样品前处理平台在生物分析领域的发展[27], [28]。Li等人开发了一种自动化磁固相萃取法与液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）联用技术，用于尿液中26种芬太尼类似物的同时分析，在30分钟内完成了32个样本的前处理[29]。Fernandes等人报道了一种自动化3D打印流通过系统，用于尿液中抗凝剂的LC-MS/MS测定[30]。其他自动化方法，包括使用液体处理机器人进行双重过滤以提取血清代谢物[31]、用于全血药物分析的96孔板自动化固相微萃取（SPME）系统[32]，以及用于治疗药物监测的全自动流动注射-SPE-高效液相色谱-荧光检测（HPLC-FLD）系统[33]，进一步证明了自动化在生物样本分析中的可行性。然而，将全自动高通量样品前处理应用于尿液中尼他泽类药物及其代谢物的综合分析仍然有限。
本研究的目的是建立并验证一种自动化PPT-UPLC-MS/MS方法，用于人尿中19种尼他泽系列类似物（图S1）的测定。该平台集成了六套8位试管架、离心管架、试剂架、自动开盖器、涡旋振荡器、离心机和X-Y-Z轴机械臂，能够在最少人工干预下批量处理多个样本。该分析工作流程针对色谱分离和机器人样品前处理进行了优化，并使用已建立的验证参数对其性能进行了评估。所开发的方法进一步应用于真实尿液标本，以评估其在法医毒理学和尼他泽监测中的实际应用价值。
章节摘要
化学品与试剂
5-氨基异妥尼他泽、美托尼他泽、异脱硝尼他泽、N-去乙基依托尼他泽和4'-羟基尼他泽购自公安部第三研究所（中国上海）。美他尼他泽、环氧尼他泽、依托尼他泽、丙酮尼他泽、异妥尼他泽、甲氧烯二氧尼他泽、乙他泽、丙酮脱硝尼他泽、依托尼他嗪、丙酮尼他嗪、5-氰基异脱硝尼他泽、N,N-二甲基氨基依托尼他泽、N-去乙基异妥尼他泽、N-去乙基甲氧烯二氧尼他泽
不同色谱柱的比较
基于此前报道的条件[34]，比较了联苯柱和BEH C18柱对尼他泽系列类似物的色谱分离性能。所评估的色谱柱为Waters Acquity Premier UPLC BEH C18（1.7 μm，100 × 2.1 mm）和Phenomenex Kinetex Biphenyl（2.6 μm，100 ?，100 × 3.0 mm）。尽管联苯柱能够在15分钟内实现所有19种化合物的分离，而BEH C18柱则需要18分钟，但BEH C18柱始终提供了
结论
本研究成功建立了一种自动化PPT-UPLC-MS/MS方法，用于人尿中19种尼他泽系列类似物的测定。该平台集成了六套8位试管架、离心管架、试剂架、自动开盖器、涡旋振荡器、离心机和X-Y-Z轴机械臂。通过自动化样品前处理与并行UPLC-MS/MS分析的结合，该系统实现了每个样本平均18.6分钟的整体处理时间。前处理
CRediT作者贡献声明
刘勇：可视化、调查研究、数据整理。施晓露：撰写——审阅与编辑、可视化。吴年：资源、调查研究。宗玉宵：验证、数据整理。童国川：软件、资源。王娜：资源、调查研究。张宏建：撰写——审阅与编辑、监督、资源。刘宜林：资源、调查研究。朱思琪：撰写——审阅与编辑、方法学、概念化。陈杰：撰写——审阅与编辑、监督。余丹霞：
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了公安部警用装备研发计划（编号：2024ZB05）、浙江省重点研发计划（编号：2025C02035）、浙江省药物防治控制重点实验室和国家毒品实验室浙江区域中心（编号：NNLZRC-2025-005）的支持。
朱思琪|余丹霞|施晓露|刘勇|宗玉宵|吴年|王娜|童国川|刘宜林|张宏建|陈杰
