噻氯匹定通过下调BMP信号通路诱导斑马鱼颅面软骨发育毒性

《Journal of Hazardous Materials Advances》：Ticlopidine induces craniofacial cartilage developmental toxicity in zebrafish via downregulation of BMP signaling

噻氯匹定（Ticlopidine）通过下调骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）信号通路诱导斑马鱼颅面软骨发育毒性。噻氯匹定破坏斑马鱼颅面软骨和骨发育；噻氯匹定抑制BMP信号通路及关键成骨基因；噻氯匹定激活咽部软骨细胞中caspase依赖性凋亡；SJ000291942（SJ）可挽救噻氯匹定诱导的颅面软骨畸形。

噻氯匹定（Ticlopidine）是一种强效P2Y12受体拮抗剂，主要通过抑制血小板聚集和血栓形成发挥治疗作用，临床上常与阿司匹林联合用于双联抗血小板治疗，以预防血栓栓塞性心血管事件和术后血栓。P2Y12受体为G蛋白偶联嘌呤能受体亚型，在血小板、尾状核、海马和丘脑等组织表达；其激活可抑制软骨细胞凋亡并保护软骨，且在斑马鱼胚胎发育中发挥作用。尽管临床有效，噻氯匹定与中性粒细胞减少、血小板减少和胆汁淤积等不良反应相关，并已有肝毒性和血液毒性证据，但其发育毒性和致畸潜力研究有限。其他模型提示噻氯匹定存在发育风险，例如非洲爪蟾胚胎致畸、秀丽隐杆线虫咽部形态异常；环境监测还发现地表水和污水中存在痕量噻氯匹定。在斑马鱼中，既往研究报告体弯、心包水肿和心动过缓等发育毒性。研究人员在本实验中观察到噻氯匹定暴露降低斑马鱼幼鱼头长和眼大小，增加细胞凋亡，提示其破坏颅面软骨发育，因此需要深入探究致畸机制。斑马鱼具有体积小、繁殖周期短、产卵量高、胚胎体外发育等优势，且与人类基因同源性高，适合非侵入性实时观察颅面发育。斑马鱼颅面结构起源于颅神经嵴细胞（cranial neural crest cells, CNCCs），10 hpf开始分段期，CNCCs开始特化；96 hpf颅面软骨发育接近完成。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）信号是CNCCs迁移、面部突起融合和骨骼矿化的主调控通路。既往环境毒物如三氯生可通过抑制BMP通路破坏斑马鱼颅面发育，而噻氯匹定可诱导凋亡和氧化应激，二者与BMP信号活性密切相关。BMP下游效应因子 smad1、smad5、id1、id2 在软骨生成和骨生成中具有关键作用，其失调常导致骨骼异常。本研究因此系统评估噻氯匹定对斑马鱼早期发育和颅面软骨的毒性，并探讨BMP相关机制。研究人员通过表型、组织学、分子和救援实验得出，噻氯匹定下调BMP信号并扰乱成骨基因，激活p53相关凋亡，SJ可部分挽救软骨畸形但未挽救矿化缺陷。该工作为噻氯匹定安全性评价和人类颅面畸形机制提供依据。

主要关键技术方法：研究人员使用野生型AB品系斑马鱼（购自中国斑马鱼资源中心，China Zebrafish Resource Center, CZRC，武汉）和研究人员所在实验室构建的Tg(col2a1a:Dendra2-NTR)转基因品系。于10 hpf暴露噻氯匹定，依据96 hpf半数致死浓度（median lethal concentration, LC₅₀）选择1.2、1.5和1.8 mg/L亚致死浓度，并联合BMP激动剂SJ000291942（SJ）进行救援。采用荧光显微形态计量、阿利新蓝和茜素红染色、苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, H&E）染色、实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）、TUNEL凋亡检测、Western blot、DCFH-DA检测活性氧（reactive oxygen species, ROS）及48、72、96 hpf时间表达分析。

研究结果：
3.1 噻氯匹定暴露对斑马鱼胚胎的发育毒性：通过10 hpf暴露并监测24、48、72、96 hpf存活率，研究人员发现死亡率浓度依赖升高，LC₅₀分别为33.60、11.40、7.25、5.889 mg/L；72和96 hpf孵化率未受影响；96 hpf体长显著剂量依赖降低。结论：噻氯匹定主要以生长损害方式诱导发育毒性。
3.2 噻氯匹定导致斑马鱼颅面软骨毒性：通过Tg(col2a1a:Dendra2-NTR)荧光成像和形态计量，发现咽弓软骨紊乱，头长、眶间距、眼深及眼直径降低，角舌软骨（ceratohyal cartilage, CH）角、CH-腭方软骨（palatoquadrate, PQ）角和麦克尔软骨（Meckel’s cartilage）角增加，CH和PQ长度降低；头长和CH长度经体长归一化后仍降低，提示非整体生长比例效应；敏感窗口为24–96 hpf。结论：噻氯匹定特异性破坏软骨生成模式。
3.3 噻氯匹定诱导咽弓软骨发育的组织病理学改变：通过阿利新蓝和H&E染色，观察到软骨基质减少，CH界限不清，Meckel软骨与PQ软骨连接模糊，软骨细胞紊乱、拥挤、水肿；qRT-PCR显示 col2a1a、pax9、fgf8a、zic2a 抑制，smad1、smad5、id1、id2 浓度依赖下调。结论：噻氯匹定干扰咽弓发育，破坏软骨细胞结构和关键基因通路。
3.4 噻氯匹定降低斑马鱼胚胎颅面骨矿化：通过茜素红染色，发现颅面骨矿化显著抑制，鳃盖骨近乎消失，副蝶骨和脊索染色减少，矿化面积降至对照约30%，各浓度间无显著差异；成骨标志 bglap、sparc、runx2b、bmp2b 下调。结论：噻氯匹定可能通过抑制成骨发育损害颅面骨矿化。
3.5 噻氯匹定诱导斑马鱼软骨细胞凋亡：通过TUNEL在转基因斑马鱼中检测，发现咽弓软骨和眼区凋亡细胞浓度依赖增加，p53、caspase3、caspase9上调。结论：噻氯匹定可能通过激活咽弓软骨细胞凋亡破坏颅面发育。
3.6 BMP激动剂挽救噻氯匹定诱导的软骨畸形：通过SJ浓度筛选，250 nM最一致恢复CH角且单独无明显毒性；与1.5 mg/L噻氯匹定共处理部分恢复咽弓软骨形态，改善头长、CH长度、CH角和Meckel角，恢复 col2a1a、pax9、fgf8a、zic2a、smad1、id1 转录，Western blot显示p-Smad1/5/9和总Smad1恢复，凋亡细胞和p53、caspase3、caspase9、bax/bcl2改变减少，ROS恢复；时间分析显示48 hpf smad1已下调而p53未变，72 hpf p53显著上调，SJ恢复smad1并使p53不再显著异于对照。但SJ未挽救矿化缺陷，救援组与噻氯匹定组矿化面积无显著差异。结论：BMP通路抑制是软骨畸形主要机制，矿化缺陷涉及额外BMP非依赖机制。

讨论部分总结：讨论指出，噻氯匹定临床用于抗血小板，孕期安全数据有限，美国FDA将其列为妊娠B类，需权衡获益与风险；本研究以斑马鱼模型在不良结局通路（adverse outcome pathway, AOP）框架下评估化学诱导颅面异常，96 hpf颅面软骨完全发育便于形态评估；与既往较高浓度研究相比，本研究较低浓度和10–96 hpf暴露窗口覆盖CNCC迁移和咽弓软骨模式形成，因而呈现不同表型。分子层面，col2a1a、pax9、fgf8a、zic2a下调提示CNCC发育破坏，但不能区分迁移、增殖或分化受损。骨矿化缺陷与成骨基因下调及rankl上调相关，提示成骨分化和破骨信号可能共同参与，但未直接评估破骨活性。凋亡方面，p53介导bax/bcl2失衡、caspase3/9激活，导致咽弓软骨细胞凋亡；ROS升高且SJ逆转，提示氧化应激位于BMP抑制下游或紧密耦合；P2Y12拮抗机制可能参与，但不能排除脱靶。BMP作为转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）超家族成员调节软骨和骨骼发生，噻氯匹定下调smad1、smad5、id1、id2，SJ部分挽救软骨表型并减少凋亡；但未挽救矿化，说明矿化缺陷可能涉及Wnt、Hedgehog、FGF或RANKL-RANK-OPG等BMP非依赖机制。研究局限包括未TRAP染色确认破骨活性，未区分膜内和软骨内骨化，暴露浓度高于环境残留，因此应视为危害识别而非环境风险评估。

结论翻译：本研究揭示，噻氯匹定暴露通过多种机制损害斑马鱼颅面发育。噻氯匹定通过下调 smad1、smad5、id1 和 id2 抑制BMP信号，同时破坏成骨标志物表达（bglap、runx2b）并激活p53介导的凋亡。通过BMP通路激活实现部分表型挽救，证实BMP信号在介导软骨畸形及相关软骨细胞凋亡中的核心作用，而持续性骨矿化缺陷表明还涉及额外的、可能BMP非依赖的机制。这些发现为噻氯匹定在颅面形态发生中的致畸潜力提供了重要见解。