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心脏衰老是年龄相关性心脏病的重要 contributing factor。然而，有效的治疗手段仍然稀缺。心肌细胞衰老是心脏衰老的标志性特征，在很大程度上独立于端粒缩短而发生，主要由DNA损伤和其他应激源触发。1 附加色体环状DNA（eccDNAs）是携带基因和非编码RNA的闭合环状结构，已被发现与酵母的衰老相关。SIR2/Sirtuin研究的研究表明，酵母中的发现往往无法扩展至动物模型，2 但eccDNAs在高等生物中的功能意义仍不确定。这凸显了在心脏衰老背景下研究eccDNA介导的调控机制的必要性。在本研究中，我们在衰老的心脏中鉴定了携带miR-144全长序列的eccDNAs，表明至少部分eccDNAs保留了完整的microRNA，而非碎片化的RNA元件。这为心肌细胞衰老提供了一个潜在的机制联系，而这种联系在酵母中尚未观察到。

为探究eccDNA衍生的非编码序列在心脏衰老中的作用，我们对老年小鼠（18月龄，n = 4）和年轻小鼠（6月龄，n = 4）的心脏进行了Circle-seq检测。3 图1a显示，四个eccDNA衍生的非编码RNA区域——MIR144、MIR100HG、MIR653和LncRNA-Ahit——在衰老的心脏中显著富集。其中，RT-qPCR验证确认MIR144表达显著上调。单细胞核RNA测序显示miR-144的主要转录本（pri-miR-144）主要在心心肌细胞中表达（图版a）。功能上，心肌细胞中MIR144的敲低显著减少了细胞衰老，表现为衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色减少和γ-H2AX下调（图版b）。总体而言，这些发现表明eccDNA衍生的MIR144是一种衰老相关的非编码RNA，选择性富集于衰老心脏的心肌细胞中，并参与心肌细胞衰老的调控。我们在老年小鼠心脏中鉴定了四个包含MIR144序列的eccDNA片段（Chr11: 77868511–78059618，77952718–78163371，77962013–77965028，和77958691–77964105）。这些片段映射到MIR144基因组区域的不同位点。我们在体外设计并合成了eccDNA-MIR144。经验证的该构建体作为后续功能分析的基础（图版c）。将六月龄小鼠分别转导表达线性MIR144的AAV9载体或eccDNA-MIR144构建体。转导后一周进行超声心动图检查发现，eccDNA-MIR144（而非其线性对应物）显著损害心脏功能。eccDNA-MIR144处理后P21和p16显著上调。Sirius Red/Masson染色显示纤维化增加，SA-β-gal染色确认eccDNA-MIR144心脏中心肌细胞衰老增强。加入eccDNA-scrambled对照进一步证实促衰老效应特异于eccDNA-MIR144，而非非特异性环状DNA。这些数据表明，eccDNA衍生的MIR144作为一种促衰老因子，在年轻小鼠中促进心脏衰老（图版d）。

图 1
图 1
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a 年轻小鼠和老年小鼠心脏中eccDNA计数的比较（n = 4，顶部1，左1）。年轻小鼠和老年小鼠心脏中特定eccDNA reads计数的热图（n = 4，顶部1，左2）。年轻小鼠和老年小鼠心脏中非编码RNA的相对表达水平（n = 4，顶部1，左3）。单细胞核测序分析揭示pri-miR144在心心肌细胞中高度特异性表达（顶部2，左1–2）。所有数据均以均值 ± SD表示，并显示个体数据点。统计分析对正态分布数据采用非配对双尾Student's t检验，对非正态分布数据采用Mann-Whitney U检验。 **P < 0.01。 b 通过RT-qPCR对从成年小鼠心脏分离的原代心肌细胞中si-NC和si-MIR144处理后的MIR144相对水平进行定量（n = 6，左1）。从成年小鼠心脏分离的原代心肌细胞中si-NC和si-MIR144处理后衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色的代表性图像（蓝色）以及SA-β-gal阳性面积的定量（放大倍数：40 ×；比例尺：50 μm，n = 6，左2–3）。从衰老成年小鼠心脏分离的原代心肌细胞中si-NC和si-MIR144处理后γ-H2AX荧光强度的代表性免疫荧光图像及定量（放大倍数：40 ×；比例尺：50 μm，左4–5，n = 6）。所有数据均以均值 ± SD表示，并显示个体数据点。统计分析对正态分布数据采用非配对双尾Student's t检验，对非正态分布数据采用Mann-Whitney U检验。 **P < 0.01。 c 染色体上包含MIR144序列的eccDNA片段的定位（顶部1）。人工合成的eccDNA-MIR144序列示意图（顶部2）。合成的eccDNA-MIR144的DNA凝胶电泳和测序验证结果（顶部3）。 d 小鼠超声心动图图像及定量指标：射血分数（EF%）、缩短分数（FS%）和左心室质量（LV mass），分别为对照组、MIR144linear和MIR144circle组（顶部1，左1–3）。小鼠对照组、MIR144linear和MIR144circle组心脏组织中p21和p16蛋白表达的Western blot代表性图像和灰度定量（顶部1，左4–5）。β-actin作为蛋白对照用于标准化蛋白表达量。小鼠对照组、MIR144linear和MIR144circle组心脏组织的Sirius Red染色（放大倍数：20 ×；比例尺：100 μm）、Masson染色（放大倍数：10 ×；比例尺：200 μm）和SA-β-gal染色（蓝色）（放大倍数：20 ×；比例尺：100 μm）结果（顶部2，左1）。小鼠对照组、MIR144linear和MIR144circle组心脏组织中Sirius Red染色和Masson染色的胶原沉积和纤维化相关指标的定量分析（顶部2，左2）。小鼠对照组、MIR144linear和MIR144circle组心脏组织中SA-β-gal阳性面积的定量（顶部2，左3）。从成年小鼠心脏分离的原代心肌细胞中ecc-scrambled和ecc-MIR144处理后SA-β-gal染色（蓝色）的代表性图像及SA-β-gal阳性面积的定量（放大倍数：40 ×；比例尺：50 μm，顶部2，左4–5）。所有数据均以均值 ± SD表示。n = 6。统计分析采用Student's t检验和单因素方差分析（One-Way ANOVA）。*P < 0.05，**P < 0.01

在本研究中，我们揭示了附加色体环状DNA（eccDNA）在心脏衰老中此前未被认识的作用。利用Circle-seq和功能实验，我们证明衰老心脏中的eccDNAs含有完整的microRNAs，并鉴定出环状MIR144是一种心肌细胞富集的、与衰老相关的转录本。与其线性对应物相比，环状MIR144在体内显著诱导心肌细胞衰老、纤维化和左心室功能障碍。组织学分析支持这些功能效应，显示衰老心脏中观察到的纤维化主要表现为间质纤维化而非血管周纤维化。尽管衰老心脏表现出质量增加，但根据衰老模型中的先前行研究，1 这很可能是由于心肌细胞肥大而非细胞增殖所致。超声心动图评估进一步确认了收缩功能受损，表现为缩短分数和射血分数降低，而舒张功能需要进一步研究。总体而言，这些结构和功能变化为环状MIR144的促衰老效应提供了生理学背景，突出了其在驱动年龄相关性心脏重塑中的核心作用。

我们的结果具有重要意义，因为它扩展了eccDNA在心脏衰老背景下的概念，从酵母功能扩展到高等生物，3,4 揭示了一个此前未被认识的有丝分裂后衰老调控层次。心肌细胞衰老在很大程度上独立于端粒缩短，由持续性DNA损伤和线粒体功能障碍驱动。3 通过鉴定eccDNA携带的miRNAs作为心脏衰老的活性调控因子，本研究为eccDNA-miRNA通路的靶向治疗铺平了道路。鉴于miRNA作为年龄相关性心血管重塑介导因子的地位日益受到认可，5 我们的研究为在心脏衰老背景下研究eccDNA-miRNA相互作用建立了框架。

我们承认，由于Letter格式的局限性，目前的数据仍是初步的。虽然我们确认了MIR144表达增加和衰老诱导，但进一步研究仍需要调查更广泛的eccDNAs类别，包括lncRNAs和编码转录本。虽然γ-H2AX是DNA损伤的标志物，但MIR144并非经典的DNA损伤应答调控因子；因此，γ-H2AX信号的增强可能反映的是与心肌细胞衰老相关的继发性DNA损伤，而非对DNA修复的直接效应。本研究未评估舒张功能，因此此处描述的心脏衰老表型主要反映收缩功能障碍和间质重塑。此外，建立循环生物标志物和解析细胞类型特异性机制至关重要，特别是在纤维化重塑的背景下。尽管存在这些局限性，我们的发现为系统研究eccDNA-MIRNAs在心脏衰老中的作用奠定了基础，并表明其可能对其他有丝分裂后组织具有相关意义。